艾灸治疗后帕金森病大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1及α-syn表达变化

王述菊，王琪，马骏，余沛豪，王中明，王彬

(湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心，武汉430065)

·基础研究·

艾灸治疗后帕金森病大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1及α-syn表达变化

王述菊，王琪，马骏，余沛豪，王中明，王彬

(湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心，武汉430065)

目的观察艾灸治疗对帕金森病大鼠黑质磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mtor)、磷酸化真核细胞起始因子4E结合蛋白1(p-4EBP1)及α-突触核蛋白(α-syn)表达的影响，探讨艾灸治疗帕金森病的作用机制。方法健康雄性SD大鼠60只，随机分为正常组、假手术组、帕金森病组、帕金森病艾灸组，每组15只。帕金森病组、帕金森病艾灸组采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备帕金森病模型，假手术组注射等浓度不含鱼藤酮的葵花油乳液，正常组不做处理。正常组、假手术组、帕金森病组不予艾灸；帕金森病艾灸组造模成功后选取足三里(双侧)、关元、风府穴施予艾灸治疗，1次/d，每次10 min，7 d为1个疗程，连续治疗2个疗程。然后对各组大鼠进行行为学评分；Western blotting检测各组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1,免疫组化法检测各组大鼠黑质α-syn。结果帕金森病组大鼠行为学评分与正常组和假手术组相比明显升高(P均lt;0.01)；帕金森病艾灸组大鼠行为学评分较帕金森病组显著降低(Plt;0.01)。与正常组、假手术组相比，帕金森病组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1、α-syn表达量明显升高(P均lt;0.01)；与帕金森病组相比，帕金森病艾灸组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1、α-syn表达量明显下降(P均lt;0.01)。结论艾灸足三里、关元、风府穴治疗帕金森病的作用机制可能是抑制了雷帕霉素靶蛋白/真核细胞起始因子4E结合蛋白通路的过度活化，遏止α-syn的过度表达，从而减轻过度表达的α-syn对多巴胺能神经元的毒性。

艾灸；帕金森病；雷帕霉素靶蛋白/真核细胞起始因子4E结合蛋白通路；磷酸化雷帕霉素靶蛋白；磷酸化真核细胞起始因子4E结合蛋白1；α-突触核蛋白

帕金森病(PD)是黑质退行性改变导致纹状体通路多巴胺(DA)含量减少所引发的一种疾病。其基本病理学标志为黑质DA能神经元的进行性丢失和残余DA能神经元中嗜酸性包涵体——路易小体(LB)的堆积[1]。研究[2]表明，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)与PD的关系复杂而密切，在神经退行性疾病如阿尔茨海默病、PD、亨廷顿舞蹈症等疾病中均表现出mtor介导的信号通路的异常。在哺乳动物中，mtor激活后[即磷酸化mtor(p-mtor)]可刺激活化其下游的直接底物之一真核细胞起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)，使其磷酸化，磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)则失去与真核细胞翻译启动因子4E(eIF4E)结合的能力，从而降低了对翻译起始的抑制作用[3]。有研究[4]发现，在α-突触核蛋白(α-syn)突变动物体中抑制mtor活性可以显著降低4EBP1磷酸化水平，改变动物的病理表现，包括肌肉变性、线粒体损害和运动能力。近年来，艾灸疗法被越来越多的应用于PD的防治中，最近的一份临床系统评价[5]显示，灸法治疗对PD患者肌强直及运动功能的改善有良好疗效，但其作用机制目前尚不清楚。基于此，2016年3月1日～2017年5月1日，我们以艾灸为干预手段，选取足三里(双)、关元、风府三穴对PD大鼠施以治疗，观察大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1及α-syn表达变化，探讨艾灸治疗PD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其分组 SPF级健康雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号为SCXK(鄂)2015-0018。所有大鼠在通风良好的条件下分笼饲养，自由摄食及饮水，适应性喂养2周后，随机分为正常组、假手术组、PD组、PD艾灸组，每组15只。实验过程中对动物的处理符合《Ethical issues in animal experimentation》[6]中的伦理学标准。

1.2 艾条、主要试剂及仪器 十年陈黄金艾条(直径为0.7 cm，河南南阳泊汐商贸有限公司)。 鱼藤酮、葵花油乳液(美国Sigma公司)，磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液、兔抗α-syn(武汉三鹰生物技术有限公司)，小鼠抗β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)，p-mtor、p-4EBP1多克隆抗体(美国bioword生物公司)，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)，浓缩型DAB试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，TEMED(Amresco)，显影定影试剂盒(天津市汉中摄影材料厂)。垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，ECL显色系统(Thermo)。

1.3 PD模型制作及鉴定 PD组、PD艾灸组采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备PD模型[7],参照陈忻等[8]的行为学评分标准对所有造模大鼠进行评分,行为学评分2～8分视为造模合格。假手术组颈背部皮下注射与模型组同等浓度的不含鱼藤酮的葵花油乳液，1次/d，连续28 d。正常组未做任何处理。

1.4 艾灸方法 造模完成后，PD艾灸组大鼠施以艾灸治疗，参照《实验针灸学实验指导》[9]中大鼠常用的针灸穴位定位方法，取足三里(双)、关元、风府三穴，每日相同时间点施灸，1次/d，每次灸10 min，7 d为1个疗程，共治疗2个疗程。其余三组大鼠不予艾灸。各组大鼠同步喂养。

1.5 大鼠行为学评分及标本采集 艾灸结束后，对各组大鼠进行行为学评分，然后各组大鼠称重后用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉。每组随机选取半数大鼠行左心室多聚甲醛内固定，取大鼠中脑黑质组织块，并用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片备检；每组另半数大鼠麻醉后快速断头取脑，于冰面上迅速分离中脑黑质组织块后置于冻存管中于-80 ℃冰箱中保存备检。

1.6 大鼠黑质组织p-mtor、p-4EBP1蛋白检测 采用Western blotting法。 ①蛋白样品制备：将上述-80 ℃保存备检的少量黑质组织块加入裂解液(含PMSF)进行匀浆，30 min后移至1.5 mL离心管中，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中并于-20 ℃保存；测蛋白浓度后，将提取的蛋白上清与5ⅹ蛋白上样缓冲液按4∶1混匀，沸水浴中变性10 min。②电泳分离：各样品按40 μg总蛋白上样，10%凝胶电泳。③转膜(湿转法)：p-mtor转膜条件为200 mA、120 min，300 mA、60 min；p-4EBP1转膜条件为200 mA、70 min；β-actin转膜条件为200 mA、90 min；④封闭：用含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。⑤一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。其中p-mtor采用1∶800比例稀释，p-4EBP1采用1∶5 000比例稀释，β-actin采用1∶200比例稀释。⑥二抗：TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次。用TBST稀释相应的HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h。⑦显色曝光：TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次。每张膜滴加适量的ECL底物液，孵育数分钟，X线胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。采用BandScan软件对目标图像进行灰度分析，p-mtor、p-4EBP1蛋白的相对表达量用目标灰度/β-actin灰度来表示。

1.7 大鼠黑质组织α-syn检测 采用免疫组化法。 将上述大鼠黑质组织切片进行常规脱蜡处理后依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%酒精、90%酒精-80%酒精-70%酒精，然后入蒸馏水浸泡2 min。采用微波进行抗原修复；用蒸馏水新鲜配置的3% H2O2滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次3 min；加一抗单克隆鼠抗α-syn于4 ℃湿盒中孵育过夜；加二抗，37 ℃孵育20 min;PBS冲洗切片3次，每次3 min；加DAB显色液，Harris苏木素复染，脱水，封片，显微镜下观察，采集图像。选定大鼠中脑黑质区域，采用IPP6.0软件对免疫组化照片进行光密度分析，每张切片选取3张400倍照片，计算其平均光密度。

2 结果

造模完成后，排除死亡、行为学评分不合格的大鼠，每组各有12只纳入检测统计。

2.1 各组大鼠行为学评分比较 艾灸结束后，正常组、假手术组、PD组、PD艾灸组大鼠行为学评分分别为0、0、(7.10±0.738)、(3.50±0.863)分；PD组评分与正常组和假手术组相比明显升高(P均lt;0.01)，PD艾灸组评分较PD组显著降低(Plt;0.01)。

2.2 各组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1的表达量比较 各组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1的表达量比较见表1。

表1 各组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1的相对表达量比较

注：与正常组、假手术组相比，*Plt;0.01；与PD组相比，#Plt;0.01。

2.3 各组大鼠黑质α-syn表达比较 正常组、假手术组、PD组、PD艾灸组大鼠黑质α-syn光密度值分别为0.006 5±0.000 7、0.008 9±0.000 9、0.028 5±0.003 1、0.017 8±0.001 8；与正常组和假手术相比，PD组大鼠黑质α-syn表达显著升高(Plt;0.01)；与PD组相比，PD艾灸组α-syn显著减少(Plt;0.01)。

3 讨论

PD是一种多因素的疾病，目前尚不能被治愈，临床治疗以左旋多巴类药物为主，其短期疗效明显，但长期应用不仅疗效减弱，且不良反应明显[10]。近年来，艾灸疗法被越来越多的应用于PD的防治中，其在改善患者症状方面取得较好的疗效[11]。

PD在中医学中属于“颤证、痉证”范畴，属本虚标实之证，肾亏脾虚是其发病之本，痰浊瘀血痹阻脑络及肝风内动为其发病之标[12]。本病患者以老年人居多，概因年老体衰，肝肾不足，髓海空虚，不能濡养四肢所致。基于上述病机，我们选取足三里、关元穴同用，其中足三里为胃经合穴，胃腑下合穴，可调理脾胃，补益气血生化之源，顾护后天之本；关元为任脉腧穴，也是足三阴经与任脉的交会穴，为元阴、元阳关藏出入之所，可益精补气，扶助人体先天之本。风府为督脉腧穴，如《行针指要赋》中言“或针风，先向风府”，且督脉从风府穴处入属于脑，故针刺风府不仅可以直达病所，祛风止颤，还有填精益髓之妙。

mtor是一种进化上相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可受生长因子、营养物质、能量等多种因素的影响，通过磷酸化其下游的靶蛋白，参与基因的转录和蛋白的表达，进而影响自噬、凋亡等生物活动[13]。mtor的直接靶点主要包括p70核糖体S6蛋白激酶和4EBP1。当mtor磷酸化4EBP1后，p-4EBP1与真核细胞翻译启动因子4E(eIF4E)的亲和力会降低并从中释放出来，降低了对翻译起始的抑制作用，间接激活了帽依赖性翻译，从而使细胞中蛋白合成加快，加速细胞生长和恶化[14]。α-syn是细胞内LB的主要成分，目前认为中脑黑质神经元中α-syn异常聚集与PD的病理过程密切相关[15]。已有证据[16]表明α-syn在细胞内含量增加和聚集会产生细胞毒性，从多途径来影响细胞的功能,最终导致细胞的死亡。因此抑制α-syn的过度表达以减少其聚集成为治疗PD的方向之一。

本研究结果显示，PD组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1及α-syn表达均明显增加，而用艾灸治疗后的PD艾灸组大鼠黑质p-mtor、p-4EBP1及α-syn表达显著减少，且行为学异常得到改善。因此推测mtor/4EBP1途径可能通过过度活化调节α-syn蛋白翻译表达而参与PD的发病。艾灸足三里、关元、风府穴可以降低PD大鼠黑质α-syn的水平及有效改善大鼠的异常行为学表现，其机制之一可能是抑制了mtor/4EBP1通路的过度活化，通过抑制蛋白翻译的起始水平，减少α-syn蛋白的过度表达，从而减轻了其对DA能神经元的毒性作用；同时由于自噬是细胞内降解异常聚集蛋白的重要途径，而mtor又是自噬的关键调节位点，抑制mtor的活性可以增强α-syn的自噬性降解。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.009

R245

A

1002-266X(2017)43-0029-03

国家自然科学基金资助项目(81403456，81473788)；针灸治未病湖北省协同创新中心项目(HBPCIC-2016-003)。

王述菊(E-mail: 361786273@qq.com)

2017-06-26)