大口黑鲈精子超微结构研究

乔志刚， 张晓光， 沈方方， 刘淑琰， 贾武

(河南师范大学水产学院，河南新乡453007)

大口黑鲈精子超微结构研究

乔志刚， 张晓光， 沈方方， 刘淑琰， 贾武

(河南师范大学水产学院，河南新乡453007)

为了解大口黑鲈Micropterussalmoides精子的超微结构，应用扫描电镜和透射电镜对大口黑鲈精子结构进行观察。结果显示，大口黑鲈精子由头部、中段和鞭毛三部分组成，扫描电镜下精子中段不明显，无顶体；精子全长25.07 μm±4.93 μm(n=30)，头部近球形，直径1.73 μm±0.29 μm(n=30)，鞭毛长23.00 μm±4.86 μm(n=30)。头部主要由细胞核构成，细胞核呈蘑菇形，染色质电子致密成簇，被电子透明区分开，核近鞭毛端向内凹陷，形成较浅的核窝。中段包括中心粒复合体和袖套，中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒构成，近端中心粒位于核窝内，与细胞核横轴平行，远端中心粒为鞭毛的基部，位于核窝外，袖套内，与近端中心粒垂直，呈“T”字形。线粒体分布在袖套两侧的袖套腔中，形状大小不一，总数(17±4)个(n=30)。鞭毛从袖套腔中伸出，主要由轴丝和侧鳍构成，轴丝与远端中心粒相接，有典型的“9+2”二联微管结构，侧鳍分布在鞭毛两侧。研究表明，大口黑鲈精子为硬骨鱼类Ⅰ型精子，其袖套形状以及线粒体的数目和大小与鲈形目Perciformes其他鱼类的精子结构存在区别。

大口黑鲈； 精子； 超微结构

硬骨鱼种类繁多，有21 000多种(杨万喜等，2000)，其生殖特点不尽相同，已有研究显示，硬骨鱼类精子结构在系统发生和生物进化过程中有很高的多样性和随机性(Guoetal.，2016)。硬骨鱼类精子结构由物种的分类地位和生殖方式共同决定。多种鱼类精子的超微结构研究表明，同一科或亚科的鱼类精子结构有很高的相似性，精子结构特征对于区分种间关系模式十分重要(Gusmão-Pompianietal.，2005；Guoetal.，2016)。此外，精子结构能与一些普通形态学特征结合在一起，更好地运用在鱼类系统发育分析中(Gusmão-Pompianietal.，2005)。

大口黑鲈Micropterussalmoides俗称加州鲈鱼、黑鲈，隶属硬骨鱼纲Osteichthyes鲈形目Perciformes鲈亚目Porcoide太阳鱼科Centrarchidae黑鲈属Micropterus，肉质鲜美、生长快、易起捕，是一种纯淡水、广温、肉食性的经济鱼类。大口黑鲈原产于美国加利福尼亚州，1983年初引入我国，经过试养与人工繁殖获得成功，已成为我国重要的淡水养殖鱼类之一(王利娟，2015)。目前，有关太阳鱼科鱼类精子结构的研究相对较少，对大口黑鲈的研究大多集中在与其生长性状相关的方面(樊佳佳等，2009；陈乃松等，2010；李镕等，2011)。本研究旨在通过对大口黑鲈精子超微结构的观察，探讨大口黑鲈精子的结构特征，丰富太阳鱼科鱼类的生殖生物学资料，为该科鱼类的繁育推广提供科学参考。

1 材料和方法

1.1材料

实验材料由河南省鹤壁市淇县淇河鲫良种场提供。在大口黑鲈性成熟季节，挑选2龄、体质量0.8 kg左右、体型健壮、健康良好的雄鱼10尾备用。

1.2方法

1.2.1采精方法采用绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)与促黄体素释放激素类似物(luteinizing hormone releasing hormone-analog，LRH-A)的混合溶液进行人工催产，催产剂量为：每千克体质量的雄鱼注射HCG 1 000 IU+LRH-A10 μg。注射后放入提前准备好的孵化池中，等待其精子成熟。水温25 ℃，30 h(效应时间)后检查精子成熟情况并采集。采精时腹部朝上，轻压腹部，挤出膀胱中的尿液，医用棉纱擦干鱼体后采集精子(要求无粪便、无血液等污染)。放入盛有2.5%戊二醛溶液的玻璃瓶中，密封，标记，4 ℃冰箱保存，用于电镜制样和实验观察。

1.2.2扫描电镜制样将上述精子样品用磷酸缓冲液(PBS，0.1 M，pH7.2～7.4)漂洗，滴加1%锇酸进行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇∶丙酮(3∶1、1∶1、1∶3)、丙酮(2次)脱水，每次10 min；二氧化碳临界点干燥，干燥后的样品放入离子镀膜仪中喷金镀膜。置扫描电镜(日立-4800)下观察并拍照。

1.2.3透射电镜制样将上述精子样品用PBS(0.1 M，pH7.2～7.4)漂洗，滴加1%锇酸进行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇∶丙酮(3∶1、1∶1、1∶3)、丙酮(2次)脱水，每次10 min；环氧树脂(Epon812)包埋，莱卡(Leica U7)超薄切片机切片，5%醋酸铀-柠檬酸铅双染法染色，日立HT-7700透射电镜观察、拍照。

1.2.4参数测量及数据统计分析采用Photoshop CS5、SPSS 20.0对图片和数据分别进行处理、分析，所有数据以平均数±标准差表示。

2 结果

扫描电镜结果显示，大口黑鲈精子由头部和鞭毛组成，中段不明显，无顶体(图版Ⅰ：1)。精子全长25.07 μm±4.93 μm(n=30)，头部近球形，直径1.73 μm±0.29 μm(n=30)，鞭毛长23.00 μm±4.86 μm(n=30)。

透射电镜结果显示，精子由头部、中段和鞭毛组成，无顶体(图版Ⅰ：4，8)。

精子头部主要由细胞核构成，细胞核由双层核膜包裹，除核底端外，周围核膜与质膜紧密相连；细胞核呈蘑菇形，染色质电子致密且高度浓缩成簇，被一些电子透明区分散开(图版Ⅰ：2)，细胞核近鞭毛端向内凹陷成较浅的核窝(图版Ⅰ：4)。成熟的精子细胞核横轴与鞭毛垂直(图版Ⅰ：4)；未成熟的精子细胞核横轴与鞭毛平行，尚未形成核窝，或细胞核发生旋转但还未旋转完全，细胞核横轴与鞭毛处于既不平行，也不垂直的状态(图版Ⅰ：3)。

精子中段由袖套和中心粒复合体组成(图版Ⅰ：4)。袖套呈筒状，连于细胞核的后端。中央的空腔称为袖套腔，袖套腔两侧袖套大小相似，内含少量细胞质、线粒体和囊泡。线粒体在两侧随机分布，总数(17±4)个(n=30)，多种形态同时存在(图版Ⅰ：4～7)。囊泡有2种类型：一种囊泡内充满电子致密物质，一种无电子致密物质。位于袖套的细胞质膜因其所处的位置不同分为袖套内膜和袖套外膜，袖套内膜位于袖套的内侧，包围袖套腔，袖套外膜位于袖套的外侧。中心粒复合体由近、远端中心粒构成。成熟的大口黑鲈精子近端中心粒位于核窝内，与细胞核纵轴垂直，远端中心粒与近端中心粒垂直，始于核窝末端，位于核窝外，并与鞭毛相连，形成鞭毛基部，近、远端中心粒均具有“9+2”二联微管结构(图版Ⅰ：4，5)。

精子鞭毛细长(图版Ⅰ：8)，起始部分位于袖套腔中，绝大部分伸出袖套之外。鞭毛的中心部分是轴丝。轴丝接于基体之后，具有典型的“9+2”二联微管结构(图版Ⅰ：4～7)。轴丝的外方存在由细胞质膜向两侧扩展而成的侧鳍(图版Ⅰ：9)。没有囊泡和线粒体等结构(图版Ⅰ：8)。

图版Ⅰ 大口黑鲈精子超微结构Plate Ⅰ The ultrastructure of sperm of Micropterus salmoides

1. 扫描电镜下大口黑鲈精子结构， 比例尺=5 μm； 2. 精子头部横切， 比例尺=1 μm； 3. 未成熟精子纵切， 比例尺=1 μm； 4.成熟精子纵切， 比例尺=1 μm； 5. 精子中段横切， 比例尺=500 nm； 6. 精子中段纵切， 比例尺=1 μm； 7. 精子中段纵切， 比例尺=500 nm； 8. 精子鞭毛纵切， 比例尺=1 μm； 9. 精子鞭毛横切， 比例尺=500 nm； AX. 轴丝， CS. 袖套腔， DC. 远端中心粒， E. 电子透明区， F. 鞭毛， H. 头部， La. 侧鳍， M. 线粒体， MP. 中段， MT. 微管， N. 细胞核， PC. 近端中心粒， V. 囊泡。

1. sperm under SEM， scale bar=5 μm； 2. cross section of the head， scale bar=1 μm； 3. longitudinal section of the immature sperm， scale bar=1 μm； 4. longitudinal section of the mature sperm， scale bar=1 μm； 5. cross section of the midpiece of the sperm， scale bar=500 nm； 6. longitudinal section of the midpiece， scale bar=1 μm； 7. longitudinal section of the midpiece， scale bar=500 nm； 8. longitudinal section of the sperm flagellum， scale bar=1 μm； 9. cross section of the sperm flagellum， scale bar=500 nm； AX. axoneme， CS. central space of the sleeve， DC. distal centriole， E. electron lucent area， F. flagellum， H. head， La. lateral fin， M. mitochondrion， MP. midpiece， MT. microtubule， N. nucleus， PC. proximal centriole， V. vesicle.

3 讨论

3.1大口黑鲈精子的分型

大口黑鲈精子分为头部、中段和鞭毛三部分，总长约25.07 μm，头部无顶体，符合硬骨鱼类精子结构的一般特征。精子细胞核发生转动，细胞核横轴与鞭毛垂直，属于Ⅰ型精子，与Baccetti等(1987)、Sprando和Russel(1988)描述的太阳鱼科精子类型一致。

3.2大口黑鲈精子头部结构特征

3.3大口黑鲈精子中段结构特征

大口黑鲈精子中段的袖套结构、线粒体数目和形态与其他鲈形目鱼类精子有明显区别。研究表明，大口黑鲈精子中段由袖套和中心粒复合体组成。袖套呈筒状，连于细胞核的后端。中央的空腔称为袖套腔，袖套腔两侧袖套大小相似，内含少量细胞质、线粒体和囊泡，符合一般硬骨鱼类精子的结构特征。线粒体在两侧随机分布，总数(17±4)个，多种形态同时存在；囊泡存在2种类型，一种囊泡内充满电子致密物质，一种无电子致密物质。研究表明，大口黑鲈精子的袖套结构十分明显，但在其他学者对诸多鲈形目鱼类精子结构的研究中，则鲜有精子中段袖套结构的报道(Lahnsteiner & Patzner，1995；García-Díazetal.，1999；Gwoetal.，2004；胡谋等，2014)，报道中所提及的中心粒复合体和线粒体被细胞质包围形成的通道与袖套的结构功能类似，但其形态差别较大；且其中的线粒体数目极少，如鲷科有1～2个线粒体(Lahnsteiner & Patzner，1995；Gwoetal.，2004)，中棘鱼科仅有1个线粒体(Jamieson，1991)，数量较多的须鲷科也仅含有5个线粒体(Mattei，1970，1991)，这些物种中线粒体的形状和结构基本相同，多为球形，个体较大，直径约1 μm，切面显示内部有线粒体，相反，大口黑鲈精子中的线粒体数目多，而体积小。分析比较其他已有的研究，大口黑鲈精子结构中的袖套结构和线粒体数目与鲤科鱼类更为相似(尤永隆，林丹军，1996)，而线粒体的形态结构却和部分两栖类动物精子的线粒体结构相似(Selmietal.，1997)。

中心粒复合体由近、远端中心粒构成。大口黑鲈成熟精子的核窝较浅，仅近端中心粒位于核窝内，与细胞核纵轴垂直，远端中心粒与近端中心粒垂直，始于核窝末端并与鞭毛相连，形成鞭毛基部，近、远端中心粒均具有“9+2”二联微管结构。一些鲈形目鱼类精子结构中核窝较深(Lahnsteiner & Patzner，1995)，其中心粒复合体多在核窝内。

3.4大口黑鲈精子鞭毛结构特征

不同鱼类的精子鞭毛侧鳍形态不同，如须鲷科羊鱼属Mullus的红鲻鱼Mullusbarbatus精子鞭毛两侧均有侧鳍；鲷科的重牙鲷Diplodussargus和牛眼鲷Boopboops精子鞭毛仅一侧有侧鳍(García-Díazetal.，1999)；而鲷科的真鲷和平鲷以及中棘鱼科鱼类精子鞭毛两侧均无侧鳍(Jamieson，1991；Lahnsteiner & Patzner，1995)。目前，关于侧鳍的作用缺乏统一解释，其生物学意义仍有待进一步验证。

陈乃松， 马建忠， 周恒永， 等. 2010. 大口黑鲈对饲料中蛋氨酸需求量的评定[J]. 水产学报， 34(8)： 1244-1253.

樊佳佳， 白俊杰， 李小慧， 等. 2009. 大口黑鲈生长性状的微卫星DNA标记筛选[J]. 遗传， 31(5)： 515-522.

胡谋， 苗亮， 李明云， 等. 2014. 黄姑鱼(Nibeaalbiflora)与大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)精子超微结构的观察与比较[J]. 生物学杂志， 31(2)： 1-4.

李镕， 白俊杰， 李胜杰， 等. 2011. 大口黑鲈生长性状的遗传参数和育种值估计[J]. 中国水产科学， 18(4)： 766-773.

王利娟. 2015. 大口黑鲈保活运输的研究[D]. 上海： 上海海洋大学.

杨万喜， 应雪萍， 竺俊全， 等. 2000. 硬骨鱼类精子发生及其在系统演化研究中的应用前景[J]. 东海海洋， 18(3)： 53-58.

尤永隆， 林丹军. 1996. 鲤鱼精子超微结构的研究[J]. 动物学研究， 17(4)： 377-383.

Baccetti B， Burrini AG， Collodel G，etal. 1987. On the undulating membranes of spermatozoa in some teleosts[J]. Acta EmbryologiaeetMorphologiae Experimentalis， 8： 215-221.

García-Díaz MM， Lorenti MJ， Gonzalez JA，etal. 1999. Comparative ultrastructure of spermatozoa of three marine teleosts of the genusSerranus：Serranusatricauda，SerranuscabrillaandSerranusscriba[J]. Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology， 31(4)： 503-508.

Guo W， Shao J， Li P，etal. 2016. Morphology and ultrastructure ofBrachymystaxlenoktsinlingensisspermatozoa by scanning and transmission electron microscopy[J]. Tissue and Cell， 48： 321-327.

Gusmão-Pompiani P， Oliveira C， Quagio-Grassiotto I. 2005. Spermatozoa ultrastructure in sciaenidae and polynemidae (teleostei： perciformes)with some consideration on percoideispermatozoa ultrastructure[J]. Tissue and Cell， 37： 177-191.

Gwo JC， Kuo MC， Chiu JY，etal. 2004. Ultrastructure ofPagrusmajorandRhabdosargussarbaspermatozoa (Perciformes： Sparidae： Sparinae)[J]. Tissue and Cell， 36(2)： 141-147.

Jamieson BGM.1991. Fish evolution and systematics： evidence from spermatozoa[M]. Cambridge： Cambridge University Press.

Lahnsteiner F， Patzner RA. 1995. Fine structure of spermatozoa of two marine teleost fishes， the red mullet，Mullusbarbatus(Mullidae)and the white sea bream，Diplodussargus(Sparidae)[J]. Journal of submicroscopic Cytology and Pathology， 27(2)： 259-266.

Lahnsteiner F， Patzner RA. 2008. Fish spermatology[M]. Oxford： Alpha Science Ltd.

Lahnsteiner F. 2003. The spermatozoa and eggs of the cardinal fish[J]. Journal of Fish Biology， 62(1)： 115-128.

Maricchiolo G， Laurà R， Genovese L，etal. 2010. Fine structure of spermatozoa in the blackspot sea breamPagellusbogaraveo(Brünnich， 1768) with some considerations about the centriolar complex[J]. Tissue and Cell， 42： 88-96.

Matos E， Matos P， Corral L，etal. 1995. Ultrastructural study of the spermatozoon ofCrenicichlasaxatilis(Pisces， teleostei) from the Amazon region[J]. Psycho Oncology， 4(1)： 33-38.

Mattei X. 1970. Spermiogeneses comparee des poisons[M]. New York： Academic Press， Inc： 57-69.

Mattei X. 1991.Spermatozoon ultrastructure and its systematic implications in fishes[J]. Canadian Journal of Zoology， 69(12)： 3038-3055.

Quagio-Grassiotto I， Gameiro MC， Schneider T，etal. 2003. Spermiogenesis and spermatozoa ultrastructure in five species of the Curimatidae with some considerations on spermatozoa ultrastructure in Characiformes[J]. Neotropical Ichthyology， 1(1)： 135-145.

Selmi MG， Brizzi R， Bigliardi E. 1997. Sperm morphology of salamandrids (Amphibia， Urodela)： implications for phylogeny and fertilization biology[J]. Tissue and Cell， 29(6)： 651-664.

Sprando RL， Russel LD. 1988. Spermiogenesis in bluegill (Lepomismacrochirus)： a study of cytoplasmic events including cell volume changes and cytoplasmic elimination[J]. Journal of Morphology， 198(2)： 165-177.

StudiesontheMicro-ultrastructureofMicropterussalmoidesSperm

QIAO Zhigang， ZHANG Xiaoguang， SHEN Fangfang， LIU Shuyan， JIA Wu

(Fisheries College， Henan Normal University， Xinxiang， Henan Province 453007， China)

The current study investigated the ultrastructure of largemouth bass (Micropterussalmoides) sperm using scanning electron microscope and transmission electron microscope. The sperm ofM.salmoideswas composed of three major parts： a nearly spherical head without an acrosome， a unconspicuous midpiece， and a slender flagellum. The full-length of sperm is 25.07 μm±4.93 μm (n=30) with a spherical head length of 1.73 μm±0.29 μm in diameter (n=30) and a slender flagellum length of 23.00 μm±4.86 μm long (n=30). The head of sperm is mainly composed of a mushroom-shaped nuclei， and the clustering electron-dense is separated by an electronlucent area. The nucleus near the flagellum segment is a depression， and it forms shallow nuclear fossa. The midpiece of sperm contains the centriolar complex and the sleeve. The centriolar complex is composed of the proximal and distal centriole. The proximal centriole is located inside the nuclear fossa and parallel to the cross axis of nuclei. The ‘T’ shape distal centriole locates outside the nuclear fossa and inside the sleeve is the base of flagellum， and it is perpendicular to the proximal centriole. There are 17±4 unequally sized mitochondria (n=30) inside the central space of both sides of sleeve. The flagellum of sperm stretched out of the central space of sleeve is mainly composed of the axoneme and the lateral fin. The axoneme comprised microtubule configurations in a ‘9+2’ microtubule pattern. The lateral fins are distributed on both sides of flagella. These results revealed that the sperm ofM.salmoidesshould be categorized as Type I， which is clearly distinct from the sperm of other species from order Perciformes in the shape of sleeve， the number and shape of mitochondria. The sleeve structure ofM.salmoidesis accord with the typical sleeve structure of teleost sperm， but the shape and the number of mitochondria ofM.salmoidesare similar with amphibian species， indicating thatM.salmoidesis more original in phylogenetic development than other species of Perciformes.

Micropterussalmoides； sperm； ultrastructure

10.11984/j.issn.1000-7083.20170205

2017-06-27接受日期2017-09-20

河南省高等学校重点科研项目(17B240003)； 淡水生态与生物技术国家重点实验室开放课题(2017FB08)

乔志刚(1965—)， 博士， 教授， 从事水产苗种工程及集约化健康养殖研究， E-mail：hnsddsyy@126.com

Q952.4； Q959.4

A

1000-7083(2017)06-0686-05