黑脉羊肚菌多酚分级制备及其抗氧化活性

廖 霞，李苇舟，郑少杰，卢可可，石 芳，吴素蕊，明 建,3,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715）

黑脉羊肚菌多酚分级制备及其抗氧化活性

廖 霞1，李苇舟1，郑少杰1，卢可可1，石 芳1，吴素蕊2，明 建1,3,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715）

以黑脉羊肚菌为原料，采用不同极性溶剂提取多酚，分别得到乙酸乙酯相、甲醇相和水相多酚提取物，通过高效液相色谱分析其组分，测定其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、2,2’-联氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基清除能力和抗氧化能力指数（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）值，并探讨该多酚提取物含量与抗氧化相关性。结果表明，黑脉羊肚菌总酚含量为20.109 mg/g，其中水相组分多酚含量最高（14.478 mg /g），甲醇相次之（5.443 mg/g），乙酸乙酯相组分多酚含量最低（0.188 mg/g）。3 种溶剂的多酚提取物组成中，荭草素含量均为最高。水相组分清除DPPH自由基能力最强，甲醇相组分清除ABTS+·能力最强，乙酸乙酯相组分具有较高的ORAC值。多酚含量与DPPH自由基清除率、ORAC值具有显著相关性（p＜0.05）。

黑脉羊肚菌；极性溶剂；抗氧化能力；高效液相色谱

羊肚菌是一种珍贵的食药用真菌[1]，属盘菌纲盘菌目羊肚菌属，因其子实体极似羊肚而得名[2]。黑脉羊肚菌（Morchella angusticeps Peck）是其中常见的品种之一，春末夏初生于针叶林地，在我国主要分布于云南、西藏、甘肃等12 个地区[3-4]。黑脉羊肚菌中富含多糖[5]、蛋白质[6]、粗纤维[7]、多种常量和微量元素[8]，是一种集营养、保健、药用功能于一体的优质资源，具有抗氧化、抗细胞增殖、增强免疫和诱导细胞凋亡等生物功能活性[9-11]。很多研究普遍认为活性多糖是羊肚菌中主要的活性物质，但也有研究发现黑脉羊肚菌体内富含多酚类物质，具有一定的抗氧化作用[12]。

由于多糖功能活性为人们熟知，因此对羊肚菌胞外多糖活性研究较多[13-15]，对羊肚菌多酚的研究比较少，对黑脉羊肚菌的研究更少。用不同极性有机溶剂萃取植物多酚的研究不少[16-17]，但关于萃取黑脉羊肚菌多酚的研究鲜见报道。孙琼[18]采用不同极性溶剂萃取杏鲍菇黄酮类化合物，其中氯仿相总黄酮含量最高，乙酸乙酯相次之，水饱和正丁醇相和石油醚相最少，且不同极性部位均有一定的抗氧化作用。本研究采用不同极性溶剂萃取黑脉羊肚菌多酚类物质，比较各萃取组分的多酚含量和抗氧化活性，分析其多酚组分，为黑脉羊肚菌综合利用和产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）、2,2’-联氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、抗坏血酸、荧光素钠盐（fluorescein disodium salt，FL）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） 美国Sigma公司；2,2’-偶氮二异丁基脒盐酸盐（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，ABAP）日本Wako Chemicals公司；芦丁 成都科龙化工试剂厂；乙腈（色谱级） 德国Merck公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

XHF-D均质机 宁波新芝生物科技有限公司；JYL-A110粉碎机 上海恒平科学仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；1-15PK离心机 美国Sigma公司；UV-2450紫外-可见分光光度计、SPD-M20A高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC） 日本岛津公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；85-2数显恒温磁力搅拌器 金坛市易晨仪器制造有限公司；5810台式高速离心机 德国Eppendorf公司；RE-5296旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LGJ-10真空冷冻干燥 北京松原华兴科技发展有限公司；KQ-100超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；722分光光度计 上海精科科学仪器厂；PB-10 pH计 德国赛多利斯公司；SpectraMax M2多功能酶标仪 美国Molecular公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

黑脉羊肚菌产自云南，由中华全国供销总社昆明食用菌研究所提供。采摘后12 h内速冻，于-20 ℃下冻藏，实验前取出冷冻羊肚菌于50 ℃烘箱烘干至恒质量，用中药粉碎机粉碎，过60 目筛后密封备用。

1.3.2 多酚提取

参考Chideh等[19]的方法，根据实验室条件稍作修改，准确称取25 g黑脉羊肚菌粉末，加入500 mL石油醚，磁力搅拌24 h，于3 500 r/min离心10 min，弃去上清液，残渣重复操作两次，弃去上清液。向离心后的残渣中加入乙酸乙酯于室温处理3 次（每次500 mL，24 h），3 500 r/min离心10 min，合并收集上清液，抽滤后于45 ℃旋转蒸干，定容至10 mL，为乙酸乙酯相提取物。离心后的残渣用甲醇处理3 次，合并收集上清液，抽滤后于45 ℃旋转蒸干，定容至25 mL，为甲醇相提取物。离心后的残渣用水处理1 次，收集上清液，抽滤后于45 ℃旋转蒸干，定容至25 mL，为水相提取物。

1.3.3 多酚含量测定

标准曲线的制作：参考Chu Yifang等[20]方法，称取25 mg没食子酸，加入适量去离子水充分溶解，定容至25 mL，得到1 mg/mL没食子酸溶液。用去离子水配制成质量浓度分别为0、20、40、60、80、100、150、200、250、300 μg/mL的没食子酸标准液。取200 μL标准液加入试管中，再依次加入800 μL去离子水、200 μL福林-酚试剂，振摇试管使样品充分混合，避光保存6 min，再加入2 mL 7% Na2CO3溶液和1.6 mL去离子水，避光条件下放置90 min后于760 nm波长处测定吸光度。以多酚质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：y＝0.003 8x+0.054（R2＝0.991 5）。

多酚含量测定：采用福林-酚法，取3 种溶剂提取获得的多酚提取液（可作适当稀释，200 μL），并用去离子水补至1 mL，后续操作同标准曲线的制备。结果以每克黑脉羊肚菌样品中所含的没食子酸当量表示，以干质量计。

1.3.4 HPLC鉴定羊肚菌多酚组分

参照Palacios等[21]的方法做适当修改，将3 种溶剂提取获得的多酚提取液和多酚标准品经0.45 μm有机滤膜过滤后使用HPLC检测。

色谱条件：色谱柱为B D S C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.1%冰乙酸；流动相B为100%乙腈，梯度洗脱程序为：0～2 min 0% B；2～5 min 5% B；5～23 min 40% B；23～28 min 80% B；28～32 min 5% B；进样量：10 μL；柱温：25 ℃；流速：0.7 mL/min；检测波长254 nm。

1.3.5 黑脉羊肚菌多酚抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率测定

参考Gangopadhyay等[22]方法并稍作修改。分别吸取100 μL的0、2.5、5、10、20、40 μg/mL不同溶剂提取的多酚提取液和100 μL 120 μmol/L DPPH溶液，一式3 份点样到96孔酶标板，37 ℃温育30 min，在515 nm波长处测定吸光度Ai。以水作空白对照，测定空白对照样吸光度Aj，抗坏血酸作为阳性对照。按公式（1）计算样品DPPH自由基清除率。

1.3.5.2 ABTS+·清除率测定

参考Soong等[23]方法测定，将5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜（12～16 h），形成ABTS储备液。将生成的ABTS储备液用10 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释，使其在室温条件下于734 nm波长处吸光度为0.70±0.02，得到ABTS工作液。将3 种溶剂提取获得的多酚提取液做相应稀释后，取3 mL的0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL不同溶剂提取的多酚提取液和1 mL ABTS工作液于10 mL试管中，以抗坏血酸为阳性对照，混合均匀后30 ℃水浴反应6 min，然后于734 nm波长处测定吸光度Ai，以水作空白对照，测定空白对照样吸光度Aj。按公式（2）计算样品ABTS+·清除率。

1.3.5.3 ORAC值测定

参照文献[24-25]的方法，并根据本实验室条件稍作修改，即分别精确吸取20 μL磷酸缓冲液（空白液）、Trolox标准液（6.25 μmol/L）和0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的不同溶剂提取的多酚提取液，一式3份点样到96 孔黑色底部透明的酶标板。在37 ℃温育10 min，加入200 μL 0.96 μmol/L荧光工作液，再在37 ℃温育20 min并间歇摇动，迅速加入新鲜配制的119 mmol/L ABAP工作液20 μL，于激发波长485 nm、入射波长520 nm条件下立即读数，每4.5 min进行一次读数，检测2.5 h，共读数35 次。根据测定值计算抗氧化能力指数（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），按公式（3）计算荧光衰减曲线下的面积（AUC），带入Trolox标准曲线，计算出1 μg/mL样品的ORAC值，结果以μmol TE/L表示。

式中：f1为第一次荧光读数值；fi为第i次荧光读数值；CT为间隔测定时间。

1.3.6 数据统计分析

数据采用Origin 8.0和Excel 2007软件统计分析，实验重复3 次，结果用 ±s表示，并用SPSS软件进行统计处理，采用ANOVA进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 黑脉羊肚菌不同溶剂提取物中多酚含量

表1 黑脉羊肚菌不同溶剂提取物中多酚含量Table 1 Polyphenol contents of various extracts from Morchella angusticeps Peck

由表1可知，黑脉羊肚菌不同溶剂提取物中多酚含量具有显著性差异，乙酸乙酯相和甲醇相含量分别为0.188、5.443 mg/g，水相组分含量为14.478 mg/g，总酚含量为20.109 mg/g，比香菇和猴头菇[26]中总酚含量高。其中水相提取物多酚含量最高，占总酚含量72%，乙酸乙酯相含量最低，与Anacristina等[27]报道的8 种欧洲食用菌中水相提取物比甲醇相提取物多酚含量高的趋势一致。

2.2 黑脉羊肚菌不同溶剂多酚提取物中多酚组分分析

通过HPLC法进一步研究黑脉羊肚菌多酚组成和含量。图1为6 种标准品的HPLC图，各种多酚标准品在色谱柱上的保留时间差异明显。通过计算标准品峰面积与含量之间的关系，得到多酚标准品的回归方程见表2。由表2可知，甲醇相中含有没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、荭草素6 种多酚类成分，水相中含有没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、荭草素5 种多酚类成分，乙酸乙酯相中含有没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、荭草素这4 种多酚类成分。除荭草素外，有关菌类文献报道过含有其他5 种多酚类成分[28-29]。3 种溶剂提取的多酚中，荭草素含量均为最高，甲醇相、水相、乙酸乙酯相中分别为339.56、3 625.05、20.97 μg/g。甲醇相和乙酸乙酯中含量最低的是对羟基苯甲酸，分别为67.81、2.09 μg/g，水相中最低的是原儿茶酸230.55 μg/g。

图1 多酚标准品HPLC色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram for a standard mixture of polyphenols

表2 黑脉羊肚菌多酚组分和含量Table 2 Polyphenol composition of various extracts from Morchella angusticeps Peck

2.3 黑脉羊肚菌不同溶剂多酚提取物清除DPPH自由基能力

图2 黑脉羊肚菌多酚提取物对DPPH自由基的清除率Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity (IC50) of polyphenols in various extracts from Morchella angusticeps Peck

DPPH自由基在有机溶剂中稳定并在517 nm波长处有强吸收，抗氧化物质能与其孤对电子配对，使光吸收减弱，从而测得清除效果[30]。在一定浓度范围内，黑脉羊肚菌多酚提取物清除DPPH自由基能力随多酚含量增加而增强。由图2可知，乙酸乙酯相、甲醇相和水相的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分别为13.070、12.363、11.754 μg/mL，与抗坏血酸相比，均较弱。其中水相多酚提取物清除DPPH自由基能力最强，与甲醇相多酚提取物相比无显著性差异（P＞0.05），但显著强于乙酸乙酯相多酚提取物（p＜0.05），这可能与不同溶剂提取的多酚组分不同有关。

2.4 黑脉羊肚菌不同溶剂多酚提取物清除ABTS+·能力

图3 黑脉羊肚菌各多酚提取物ABTS＋·清除率Fig. 3 ABTS radical scavenging capacity (IC50) of polyphenols in various extracts from Morchella angusticeps Peck

ABTS经活性氧氧化后，可生成稳定的蓝绿色阳离子ABTS+·，抗氧化物质可与ABTS+·发生反应而使反应体系退色，根据吸光度的变化可以测定抗氧化能力[31]。在一定浓度范围内，随着多酚含量增加，ABTS+·清除率增强。由图3可知，乙酸乙酯相IC50值最大（0.466 μg/mL），显著高于水相（0.440 μg/mL）（p＜0.05），甲醇相IC50值为0.308 μg/mL，显著低于水相（p＜0.05），表明甲醇相组分具有较好的ABTS+·清除能力。3 种溶剂的多酚提取物对ABTS+·清除率均高于抗坏血酸。

2.5 黑脉羊肚菌不同溶剂多酚提取物ORAC值

图 4 黑脉羊肚菌多酚提取物ORAC值Fig. 4 ORAC values of polyphenols in various extracts from Morchella angusticeps Peck

根据ABAP自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化的原理，以Trolox为定量标准，荧光强度变化大小反映ABAP的破坏程度，当抗氧化剂存在时，它可延缓ABAP引起的荧光变化，其抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力[32]。ORAC值越大，抗氧化能力越强。由图4可知，3 种溶剂多酚提取物中，乙酸乙酯相抗氧化能力最强，ORAC值为101.408 μmol TE/L，显著高于甲醇相的81.483 μmol TE/L（p＜0.05），而水相的ORAC值最低，为41.345 μmol TE/L，不足乙酸乙酯相多酚ORAC值的一半，且显著低于甲醇相（p＜0.05）。

2.6 黑脉羊肚菌3种多酚提取物含量与抗氧化能力相关性分析

表3 多酚提取物含量与抗氧化能力相关性Table 3 Correlation between polyphenol contents and antioxidant activity

黑脉羊肚菌多酚提取物含量与抗氧化能力相关性分析结果见表3。多酚含量与DPPH自由基清除率呈显著负相关（p＜0.05），与ORAC值呈极显著负相关（p＜0.01），而多酚含量与ABTS+·清除率相关性很差。抗氧化评价方法之间，除DPPH自由基清除率与ORAC值有显著正相关性（p＜0.05），其余间均无显著相关性。由于，不同抗氧化活性评价方法的作用机理不同，也会导致评估结果不同，采用不同的抗氧化活性评价方法，更能全面体现其生物学意义[33]。

3 结 论

黑脉羊肚菌总酚含量为20.109 mg/g，其中水相组分含量最高为14.478 mg/g，贡献率占72%，乙酸乙酯相组分含量最低为0.188 mg/g，甲醇相含量为5.443 mg/g。采用HPLC分析3 种不同溶剂获得的多酚提取物组分，初步鉴定甲醇相中含有6 种已知多酚类成分，水相中含有5 种，乙酸乙酯相中含有4 种，且荭草素含量均为最高，甲醇相、水相、乙酸乙酯相中分别为339.56、3 625.05、20.97 μg/g。体外抗氧化结果表明，水相多酚提取物清除DPPH自由基能力最强，甲醇相多酚提取物清除ABTS+·能力最强，而乙酸乙酯相ORAC值最高。可见，3 种不同溶剂提取的多酚抗氧化效果不相同，这与3 种溶剂多酚提取物的组分不同、粗提物中其他非酚类抗氧化化合物的存在及各化学抗氧化方法原理不同有密切关系。

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Fractionation and Antioxidant Activity of Polyphenols from Morchella angusticeps Peck

LIAO Xia1, LI Weizhou1, ZHENG Shaojie1, LU Keke1, SHI Fang1, WU Surui2, MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2. Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Kunming 650223, China;3. Chongqing Engineering Research Center for Special Foods, Chongqing 400715, China)

Phenolic components were sequentially extracted from Morchella angusticeps Peck using solvents with different polarities. As a result, ethyl acetate extract, methanol extract and water extract were obtained, and the phenolic components were identified by high performance liquid chromatography. Then, the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity, 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) radical scavenging capacity and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) of the extracts were determined, and the correlation between phenolic contents of the extracts and antioxidant activity was investigated. The results revealed that the total polyphenol content of M. angusticeps Peck was approximately 20.109 mg/g. The highest content of polyphenols (14.478 mg/g) was detected in the water extract, followed by the methanol extract (5.443 mg/g), and the ethyl acetate extract had the lowest content of polyphenols(0.188 mg/g). Orientin was the most abundant in all three extracts. The DPPH radical scavenging capacity of the water extract was the strongest, the methanol extract possessed the highest ABTS radical scavenging capacity, and ethyl acetate extract exhibited the highest ORAC value. An excellent correlation between ABTS radical scavenging activity or ORAC value and polyphenol contents was observed.

Morchella angusticeps Peck; polar solvents; antioxidant activity; high performance liquid chromatography

10.7506/spkx1002-6630-201723005

TS201.2

A

1002-6630（2017）23-0026-06

廖霞, 李苇舟, 郑少杰, 等. 黑脉羊肚菌多酚分级制备及其抗氧化活性[J]. 食品科学, 2017, 38(23): 26-31.

10.7506/spkx1002-6630-201723005. http://www.spkx.net.cn

2017-02-20

国家自然科学基金面上项目（31471576）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2016E113）；

云南省科技厅科技创新人才计划项目（2008OC008）；

重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目（cstc2014pt-gc8001）

廖霞（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：994671521@qq.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：mingjian1972@163.com

LIAO Xia, LEI Weizhou, ZHENG Shaojie, et al. Fractionation and antioxidant activity of polyphenols from Morchella angusticeps Peck[J]. Food Science, 2017, 38(23): 26-31. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723005. http://www.spkx.net.cn