引药米酒对瓜蒌薤白中3，29-DK在人工胃液中降解影响的研究

鄢海燕，贾文茜，邹纯才

（皖南医学院药学院，安徽芜湖 241002）

引药米酒对瓜蒌薤白中3，29-DK在人工胃液中降解影响的研究

鄢海燕，贾文茜，邹纯才

（皖南医学院药学院，安徽芜湖 241002）

目的：研究米酒对瓜蒌薤白中3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇（以下简称3，29-DK）在人工胃液中降解程度的影响。方法：使用HPLC-SPD技术，分析人工胃液中瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液的3，29-DK 1、2、3、4 h的降解率。结果：与瓜蒌薤白水溶液相比，瓜蒌薤白米酒溶液中3，29-DK在人工胃液中各时间点的降解率明显降低且差异有统计学意义（P＜0．01）。以水和米酒分别作为溶媒时，其降解率的AUC0-t（mg·min·L）值为（140．84±3．65）和（78．17±5．83）（xˉ±s，n=3），二者间差异有统计学意义（P＜0．01）。结论：引药米酒可抑制3，29-DK在人工胃液中的降解。

引药米酒；瓜蒌薤白白酒汤；3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇；人工胃液；降解

古方中记载的瓜蒌薤白白酒汤，是现代临床治疗胸痹症的经典方剂〔1-4〕。在该方剂中，瓜蒌为君药，薤白为臣药，白酒（即为现代的米酒）为引药，有温通上行之功效〔5〕。在《中国药典》（2015年版）中，3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇（以下简称3，29-DK）被用作瓜蒌子的定量评价指标〔6〕。为深入研究米酒对瓜蒌薤白中3，29-DK在人工胃液中降解程度的影响，本实验制备了瓜蒌薤白60%乙醇提取物的水溶液和米酒溶液（简称瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液），使用HPLC-SPD（High performance liquid chromatography-serial presence detect）技术，研究引药米酒对3，29-DK在人工胃液中降解的影响，以期为深入全面的探究瓜蒌薤白白酒汤的配伍机制，特别是引药米酒对该方剂的影响提供理论依据。

1 仪器与材料

1．1仪器FA2004型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；岛津LC-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；pHS-3C型酸度计（上海皓庄仪器有限公司）；KYC-100C空气恒温摇床（上海沪粤明

科学仪器有限公司）；SK-1快速混匀器（上海精密科学仪器有限公司）；JW-2017H高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）。

1．2材料瓜蒌、薤白（河北安国市御颜坊中药材有限公司，批号：20160801），经皖南医学院生药学包淑云副教授鉴定，瓜蒌为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim．的干燥成熟果实，薤白为百合科植物小根蒜Allium macrostemon Bge．的干燥鳞茎；3，29-DK（成都普菲德生物技术有限公司，含量≥98%，批号：20141110）；白糯米酒（宁波佳酿有限公司，批号：20141210）；Pepsin（生化试剂，南京奥多福尼生物科技有限公司，批号：20160515）；甲醇（色谱纯，永华化学科技（江苏）有限公司，批号：20160511），娃哈哈纯净水（娃哈哈集团有限公司，批号：20160304），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1溶液制备

2．1．1 3，29-DK对照品溶液 取经硅胶干燥至恒重的对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，以甲醇为溶剂，配制质量浓度为0．10 mg∕mL的3，29-DK对照品溶液，备用。

2．1．2 瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液的制备 取经50℃干燥24 h的瓜蒌、薤白适量，粉碎成粗粉，精密称定并按1．5：1比例均匀混合后，加10倍量60%乙醇，回流提取1 h，重复操作3次，将所得滤液均分成2份，回收溶剂后，再分别用水和米酒定容成每1 mL含瓜蒌薤白混合药材0．5 g药液，得瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液。

2．2人工胃液（以下简称胃液）的制备称取胃蛋白酶10 g，加以80倍量蒸馏水，取稀盐酸（取浓盐酸23．4 mL，加蒸馏水定容至100 mL，得9．5%～10．5%稀盐酸）16．4 mL，混匀，加水定容至1 000 mL，摇匀〔7〕。

2．3瓜蒌薤白水溶液中3，29-DK在胃液中的降解精密量取瓜蒌薤白水溶液20．00 mL、胃液80．00 mL，混合均匀，分别精密量取4．00 mL混合液于15个50 mL尖底离心管中（5个时间点，每个时间点平行试验3次），恒温摇床（150 r∕min，37℃）培养，在0、1、2、3、4 h分别取出，立即用0．5 mol∕L NaOH溶液停止反应，并用 0．5 mol∕L NaOH 溶液调 pH 至 7．0，再加24 mL甲醇超声20 min，沉蛋白，5 000 r∕min高速离心，20 min后取上清液，挥干甲醇。所得残渣以二氯甲烷萃取3次，每次加入二氯甲烷8 mL，涡旋20 s，3 500 r∕min离心，5 min后取出下层萃取液，合并3次萃取液，挥干。所得残渣用200 μL甲醇复溶，取上清液，备用。

2．4瓜蒌薤白米酒溶液中3，29-DK在胃液中的降解精密量取瓜蒌薤白米酒溶液20．00 mL、胃液 80．00 mL，混合均匀，照“2．3”方法，自“分别精密量取4．00 mL混合液”起操作，备用。

2．5色谱条件色谱柱：AgelaTechnologiesInnoval-C18（5μm，250mm×4．6mm）。等度洗脱，流速为1．0mL∕min，流动相为甲醇：水（90：10）。SPD-20AV紫外检测器，检测波长为231 nm。CTO-20A柱温箱，柱温为25℃。SIL-20AC自动进样器，进样量为20 μL。

2．6统计学方法用SPSS 11．5软件对数据进行统计学处理。P＜0．05为差异有统计学意义。

2．7标准曲线的建立精确量取“2．1．1”中对照品溶液，分别稀释成2．0，4．0，8．0，16．0，32．0，64．0 μg∕mL，按“2．5”HPLC条件，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X，μg∕mL）进行回归分析，结果表明，标准曲线在2．0～64．0 μg∕mL范围内呈现良好的线性关系。回归方程为：Y=33 223 428．571 4X-44 911．333 3（r=0．998 6）。

2．8方法学验证

2．8．1 专属性考察 在“2．5”的HPLC条件下，记录胃液、3，29-DK对照品、瓜蒌薤白水溶液及米酒溶液、瓜蒌薤白水溶液及米酒溶液与胃液混合后（4 h）的HPLC图。结果分析得胃液、瓜蒌薤白中其他成分及瓜蒌薤白在胃液中的降解产物不影响3，29-DK的定量。见图1。

2．8．2 精密度考察 精密量取瓜蒌薤白水溶液样品，按“2．3”中的降解方法，以“2．5”的色谱条件，选用0 h样品，连续进同一样品5次。所得RSD为0．07%，结果表明精密度较好。

2．8．3 稳定性考察 精密量取瓜蒌薤白水溶液样品4．00 mL，不进行酶解处理，以“2．3”的方式萃取，照“2．5”的色谱条件，分别于 0、2、4、8、16、32 h进行检测。RSD为0．33%（n=6），则在32 h内样品溶液处于稳定状态。

2．8．4 重复性考察 取瓜蒌薤白水溶液样品5份，按“2．3”中方法降解，以“2．5”色谱条件，分别于0 h进样，RSD为0．04%，表明方法重复性较好。

2．8．5 加样回收率 取已知3，29-DK含量的药材水洗溶液样品3组，每组3份，在3组中分别加入检测成分含量的120%、100%、80%的对照品，按“2．5”HPLC条件，结果可得加样回收率为101．9%，RSD为1．10%。

2．9瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中降解率的考察制备瓜蒌薤白药材溶液各3批，以水和米酒分别洗下，按“2．3”和“2．4”项下的方法操作制备瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液在胃液中不同时间点的供试样品，以“2．5”项下的条件进样测定，计算不同时间点3，29-DK在胃液中的降解率，即：

图1 瓜蒌薤白水溶液及米酒溶液中3，29-DK的专属性考察HPLC色谱图

其中：ct为瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中t小时时的浓度（μg∕mL）（t=0，1，2，3，4 h）；c0为瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中0 h时的浓度（μg∕mL）。见图2。

由图2可知，以水和米酒作为溶媒的瓜蒌薤白溶液，3，29-DK在胃液中均有不同程度降解，且随时间成正相关。在米酒的作用下，瓜蒌薤白药液中3，29-DK在胃液中1～4 h各时间点的降解率，较瓜蒌薤白水溶液明显降低且差异具有统计学意义（P＜0．01）。由DAS 2．0 分析可获得两溶液中3，29-DK降解率的AUC0-t（mg·min·L）值〔8〕，分别为（140．84±3．65）和（78．17±5．83）（ xˉ±s，n=3），二者间差异具有统计学意义（P＜0．01），说明引药米酒可抑制3，29-DK在人工胃液中的降解。

图2 瓜蒌薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中随时间的降解率（xˉ±s，n=3）

3 讨论

食物由胃排入十二指肠的过程称为胃排空。健康人的胃排空时间多不超过4 h〔9〕。结合文献〔10〕，本试验将3，29-DK在胃液中的降解率的考察时间设计为4 h。试验发现，1 h时，瓜蒌薤白水及米酒溶液中3，29-DK在胃液中的降解率分别为（21．52%±2．18%）和（5．01%±1．44%），1～4 h瓜蒌薤白水及米酒溶液中3，29-DK在胃液中降解线性方程分别为Y=11．57X+11．28（r=0．9619），Y=11．70X-4．95（r=0．9925），两条曲线基本平行，但在纵坐标上的截距明显不同。因此，米酒主要在0～1 h可有效抑制3，29-DK在胃液中降解，也是后续各时间点瓜蒌薤白米酒溶液中3，29-DK降解率较瓜蒌薤白水溶液中低的基础。实验结果显示，米酒抑制瓜蒌薤白药液中3，29-DK在胃液中的降解，导致这种结果的可能原因有两个：一是米酒中的蛋白质等成分和胃液作用，降低了胃液对3，29-DK的降解能力；二是米酒在减弱胃蛋白酶的活性方面发挥作用。

〔1〕李英，惠朋利．瓜蒌薤白白酒汤合丹参制剂治疗不稳定型心绞痛临床研究〔J〕．中医学报，2015，30（7）：1044-1046．

〔2〕吴晶晶，丁舸．瓜蒌薤白白酒汤核心药组浅析〔C〕∕呼和浩特：全国第二十二次仲景学说学术年会论文集．2014．

〔3〕陈素慧．瓜蒌薤白汤的研究进展〔J〕．天津药学，2013，25（2）：60-62．

〔4〕卞海，王雅娟，黄顺，等．瓜蒌薤白白酒汤对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕．中成药，2013，35（11）：2347-2352．

〔5〕范铁兵，杨志旭．仲景所用溶媒探析〔J〕．辽宁中医药大学学报，2012，14（7）：133-136．

〔6〕国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部〔M〕．北京：中国医药科技出版社，2015：112．

〔7〕国家药典委员会．中华人民共和国药典：四部〔M〕．北京：中国医药科技出版社，2015：119．

〔8〕刘玲，赵晓莉，狄留庆，等．采用体外肠道菌群实验研究防风对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷代谢的影响〔J〕．南京中医药大学学报，2015，31（2）：170-173．

〔9〕刘硕艺．100例胃排空时间x线观察〔J〕．刑事技术，1984（1）：14-16．

〔10〕卢凤来，黄振聪，颜小捷，等．罗汉果皂苷V在人工胃液中的稳定性和体外代谢研究〔J〕．广西植物，2015，35（6）：792-795．

（责任编辑 李 杨）

A Study on the Effect of Rice Wine as Cites Drug on Degradation of 3，29-Dibenzoyl-Karounitriol in Gualou-Xiebai in Artificial Gastric Juice

Yan Haiyan,Jia Wenqian,Zou Chuncai
（College of Pharmacy,Wannan Medical College,Wuhu,Anhui 241002,China）

Objective:To study the effects of rice wine as cites drug on the metabolism of 3,29-dibenzoyl-karounitriol as the main active component in Gualou-Xiebai in artificial gastric juice．Methods:The degradation rate of 3,29-dibenzoyl-karounitriol in Gualou-Xiebai rice aqueous solution and wine solution in artificial gastric juice were analyzed after 1 h,2 h,3 h and 4 h by the use of HPLC-SPD．Results:Compared with Gualou-Xiebai aqueous solution,the degradation rate of 3,29-dibenzoyl-karounitriol in Gualou-Xiebai rice wine solution in artificial gastric juice at each time point was significantly reduced and there was a significant difference（P＜0．01）．The AUC0-t（mg·min·L）of the degradation rate were（140．84 ± 3．65）and（78．17 ± 5．83）（xˉ± s，n=3）when the water and rice wine were used as the solvent respectively,and there was a significant difference between them（P＜0．01）．Conclusion：Rice wine as cites drug can effectively inhibit the degradation of 3,29-dibenzoyl-karounitriol in Gualou-Xiebai in artificial gastric juice．

rice wine as cites drug;Gualou-Xiebai;3,29-dibenzoyl-karounitriol;artificial gastric juice;degradation

R945

A

2096-2266（2017）10-0015-04

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．004

安徽高校省级自然科学研究重大项目（KJ2015ZD41；KJ2016SD60）；安徽省科技攻关项目（12010402089）；国家大学生创新创业训练计划资助项目（201510368018）

2017-02-13

2017-07-05

鄢海燕，教授，主要从事药物制剂及其质量控制研究．