金丝桃苷对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎Nrf2/ARE信号通路的作用

杨 雷， 李 越， 李艳霞， 余世界， 王珊珊， 沈 磊

武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060

论著·肠相关疾病

金丝桃苷对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎Nrf2/ARE信号通路的作用

杨 雷， 李 越， 李艳霞， 余世界， 王珊珊， 沈 磊

武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060

目的探讨金丝桃苷(Hyperoside，Hyp)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠肠黏膜Nrf2/ARE信号通路的影响。方法用DSS 诱导结肠炎小鼠模型，实验设对照组、模型组、DSS+Hyp低剂量组(DSS+Hyp 80 mg/kg)、DSS+Hyp高剂量组(DSS+Hyp 120 mg/kg)，每组6只；质量浓度为30 g/L的DSS自由饮水7 d制成结肠炎小鼠模型同时于造模前7 d开始予Hyp灌胃治疗，连续14 d。观察小鼠结肠炎疾病活动指数(DAI)和结肠组织病理变化，Western blotting法检测小鼠结肠组织细胞核核转录因子(Nuclearfactor-erythroid 2-rdated factor-2，Nrf-2)表达水平，RT-PCR检测小鼠结肠组织Nrf-2、超氧化物歧化酶(SOD)表达水平。结果与模型组比较，对照组、Hyp+DSS诱导组的结肠炎小鼠DAI降低(P<0.01)。Hyp能够明显改善结肠病理损伤。与模型组比较，Hyp明显提高Nrf2的表达(P<0.05)。对照组、Hyp+DSS诱导组小鼠结肠SOD mRNA的相对表达量与模型组比较显著升高(P<0.05)。结论Hyp对DSS诱导的结肠炎小鼠模型有保护作用，其作用机制可能与Nrf2/ARE信号通路有关。

金丝桃苷；溃疡性结肠炎；Nrf2/ARE通路；抗氧化

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的一种常见临床类型，具有慢性复发性非特异性肠道炎症的特点。目前IBD病因及发病机制尚不明确，缺乏满意的治疗方法。研究[1-2]发现，氧化应激在UC的发生、发展中起着重要作用，而Nrf2/ARE通路被认为是机体抗氧化应激最重要的通路，与UC的发生、发展密切相关。金丝桃苷(Hyperoside，Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛、调节免疫功能等多种药理活性。实验[3]发现在CCl4诱导的小鼠肝损伤模型中，Hyp能够通过激活Nrf2，增强抗氧化酶的表达，具有很强的抗氧化作用。同时在细胞实验中也证明,Hyp可通过促进Nrf2基因的表达，增强细胞内的抗氧化活性[4]。因此本实验选用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠建立急性UC模型，予模型小鼠灌胃Hyp进行干预。研究Hyp对急性UC模型小鼠肠黏膜的影响及Nrf2/ARE信号通路的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物和主要试剂实验选用清洁级7～8周C57BL/6雄性小鼠24只，体质量18～20 g，购自北京华阜康生物科技有限公司。Hyp购自上海源叶生物科技有限公司。DSS购自美国MP Biomedicals公司，兔Nrf-2抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2实验方法C57BL/6小鼠24只，随机分为4组：对照组、模型组、DSS+Hyp低剂量组(80 mg/kg)、DSS+Hyp高剂量组(120 mg/kg)，每组6只。除对照组外，其余各组将饮水中加入DSS粉末，制成质量浓度为30 g/L的DSS溶液给小鼠自由饮用，连续7 d，制成结肠炎模型。造模前7 d开始小鼠灌胃给药，1次/d，连续14 d，Hyp溶于质量浓度为5 g/L的羧甲基纤维素钠中；小鼠给药浓度按由低剂量到高剂量每次0.2 ml/10 g灌胃，按照小鼠体质量计算药量给药。

1.3疾病活动指数(diseaseactivityindex,DAI)评分及组织学评价从实验第1天开始，每天观察并记录各组小鼠饮食量、体质量、粪便及活动情况。从第7天开始进行DAI评分，根据大鼠的体质量、粪便性质和肠道出血情况评为1～4分[5]。

1.4病理检查实验第15天颈椎脱臼法处死小鼠(处理前禁食1 d)，迅速取出整段结肠，用预冷的PBS冲洗干净取病变最明显处组织，一部分固定于质量浓度为10 g/L甲醛，常规脱水、浸蜡、透明、包埋，5 μm切片，行HE染色。

1.5Westernblotting检测Nrf2蛋白的相对表达量取肠组织，按说明书提取细胞核蛋白并测定蛋白含量。Western blotting法参照文献[6],采用Image J图像分析软件测定条带灰度值，以目的条带灰度值与laminB 灰度值的比值反映各组细胞核Nrf2蛋白表达情况。

1.6Nrf-2、SODRT-PCR分析采用SYBR GreenⅠ荧光染料嵌合法，分别制作目的基因(Nrf-2，SOD)和管家基因(GAPDH)的标准曲线。利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别定量。通过管家基因的校正，检测各组Nrf-2、SOD目的基因的相对表达量。引物序列: Nrf-2: 5′-GAGCTAGATAGTGCCCCTGG-3′；SOD: 5′-AACCATCCACTTCGAGCAGA-3′。

2 结果

2.1小鼠一般情况和DAI造模前，各组小鼠饮食量、体质量及活动无明显差异，造模开始第3天起，模型组小鼠出现了严重的腹泻和血便，体质量开始明显下降，饮食减少，少动，实验中无动物死亡。与模型组比较，对照组、DSS+Hyp低剂量组、DSS+Hyp高剂量组DAI评分降低，差异有统计学意义(P<0.01，见表1)。

表1 各组DAI评分Tab 1 The DAI of mice in different groups (±s)

注：与模型组比较，t=-34.66、-11.04、-20.41，*P<0.01。

2.2病理检查结果对照组结肠黏膜结构完整，无炎性细胞浸润，模型组结肠黏膜上皮细胞广泛缺失，腺体大多数不完整，可见明显的糜烂及溃疡形成，炎症细胞广泛浸润，呈典型炎症改变；DSS+Hyp低剂量组结肠黏膜腺体部分不完整，局部有少量炎性细胞浸润或隐窝破坏，DSS+Hyp高剂量组结肠黏膜腺体基本完整，局部有少量炎性细胞浸润或隐窝破坏，与模型组比较差异明显(见图1)。

图1 各组小鼠结肠组织病理改变(HE 200×) A：对照组；B：模型组；C：DSS+Hyp高剂量组；D：DSS+Hyp低剂量组Fig 1 The pathological changes of colon in different groups(HE 200×)A: control group; B: model group; C: DSS+Hyp high dose group; D: DSS+Hyp low dose group

2.3Westernblotting检测结果治疗14 d后各组结肠细胞核Nrf2蛋白的相对表达量均高于模型组。与模型组比较，Hyp明显增加Nrf2的表达，差异有统计学意义(P<0.00，见图2)。

2.4RT-PCR分析结果治疗14 d后各组结肠细胞核Nrf2、SOD mRNA相对表达量均高于模型组。与模型组比较，Hyp明显增加Nrf2的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、DSS+Hyp低剂量组、DSS+Hyp高剂量组小鼠结肠SOD mRNA的相对表达量与模型组比较显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

3 讨论

UC是目前临床治疗的难点之一，其发病机制至今尚未明确，现认为UC发病机制可概括为：环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌群的参与下，启动了难以停止的、发作与缓解交替的肠道天然免疫及获得性免疫反应，导致肠黏膜屏障损伤、溃疡经久不愈、炎性增生等病理改变。因此多因素多机制参与UC的发生与发展，多项研究[1-2]表明，氧化损伤在UC的发生、发展过程中起着重要作用，Nrf2/ARE通路以启动ARE调控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白基因的转录及翻译，表达相关蛋白，参与抗氧化应激作用。

注：1：对照组，2：模型组，3：Hyp低剂量组，4：Hyp高剂量组；与对照组比较，t=1.634、4.00、5.61，*P<0.01。图2 Hyp对小鼠肠结肠黏膜细胞核Nrf2蛋白含量表达影响 Fig 2 Effects of Hyp on the expression of nuclear Nrf2 in colorectal tissue of mice

组别只数Nrf2mRNASODmRNA对照组61.06±0.240.99±0.17**模型组60.71±0.190.53±0.14DSS+Hyp低剂量组61.39±0.30*0.83±0.12*DSS+Hyp高剂量组62.69±0.43**1.35±0.16**

注：与模型组比较，Nrf2 mRNA:t=1.39、2.72、7.99；SOD mRNA：t=3.83、2.48、6.76，*P<0.05，**P<0.01。

Nrf2/ARE通路能够缓解炎症相关的多种疾病，包括炎症性肠病[7]。Nrf2是具有亮氨酸拉链结构的CNC转录因子家族成员之一[8]，Nrf2通过亮氨酸拉链结构域与sMaf蛋白或Jun蛋白形成异二聚体，再与抗氧化反应原件(antioxidant response element，ARE)相结合，从而启动目标基因转录，提高细胞对亲电子及活性氧(ROS)的清除能力，在机体对抗氧化应激反应中起着关键性的作用[9]，研究[10]显示，在DSS诱导的UC小鼠模型中，Nrf2的表达显著下降，且与野生型小鼠相比，Nrf2基因缺陷小鼠DAI升高更明显，Nrf2调控的抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、血红素加氧酶1(HO-1)，谷胱甘肽S-转移酶M1(GSTM1)，苯醌氧化还原酶(NQO1)的mRNA和蛋白表达水平明显下降，这表明Nrf2基因敲除的小鼠通过减少抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表达而对DSS诱导的UC有高度易感性，揭示Nrf2/ARE通路在DSS诱导UC中的作用[11]。

本动物实验表明，应用DSS制作的小鼠结肠炎动物模型，在造模第3天开始，即出现了体质量降低、腹泻和便血等症状，病理上出现肠黏膜溃疡，充血、出血、炎性细胞浸润，提示本研究小鼠模型基本接近UC的临床及病理表现。与模型组比较，灌胃Hyp后可以使UC模型小鼠的体质量增加，大便性状及便血明显改善，DAI评分明显降低，结肠病理改变明显减轻，表明灌胃Hyp对小鼠UC有明确保护作用。本实验还发现，模型小鼠肠道黏膜组织Nrf-2蛋白及Nrf-2 mRNA表达水平下降，SOD mRNA表达水平明显降低；而给予Hyp干预可以显著上调Nrf-2、SOD的表达水平。另外，Hyp增加细胞核Nrf-2表达，说明其可以促进Nrf-2核转位进而激活Nrf2/ARE通路，上调抗氧化酶的表达，达到对DSS诱发小鼠UC结肠黏膜的保护作用。

综上所述，本研究证实，Hyp能够对DSS诱导的小鼠结肠炎模型具有非常好的保护作用，能够通过改善临床症状，减弱肠道炎性反应对结肠炎发挥治疗作用。同时，Hyp能够上调Nrf-2及SOD水平，说明Hyp可能是通过调控Nrf2/ARE通路来发挥免疫调节作用的，为Hyp治疗UC炎提供了新的分子机制理论。

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(责任编辑：马 军)

EffectsofHyperosideonNrf2/AREsignalingpathwayindextransulfatesodium-inducedcolitisinmice

YANG Lei, LI Yue, LI Yanxia, YU Shijie, WANG Shanshan, SHEN Lei

Department of Gastroenterology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China

ObjectiveTo investigate the effects of Hyperoside (Hyp) in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice on Nrf2/ARE signaling pathway.MethodsColitis mice model was induced by DSS, a total of 24 healthy male mice were divided into control group, model control group, DSS+Hyp low dose group (DSS+Hyp 80 mg/kg) and DSS+Hyp high dose group (DSS+Hyp 120 mg/kg), six mice in each group. The Hyp treatment, continuous 14 days, began from one week before the experimental acute colitis which was induced by DSS with a mass concentration of 30 g/L in the drinking water of mice for 7 days. The disease activity index (DAI) and histological analysis were examined. The colorectal tissues levels of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) was detected by RT-PCR and Western blotting. The colorectal tissues level of SOD mRNA was assessed by RT-PCR.ResultsCompared with model control group，the scores of DAI in healthy control group and Hyp dose group were lower (P<0.01). Hyp significantly attenuated the colon histological damage. Compared with model control group, the expression of nucleus Nrf2 protein and the levels of Nrf2 mRNA were higher in Hyp dose group (P<0.05). The level of SOD mRNA in control group and Hyp dose group was significantly improved when compared with that in model group (P<0.05).ConclusionHyp exhibites protective effect on DSS-induced colitis mice model possibly through the Nrf2/ARE signaling pathways.

Hyperoside; Ulcerative colitis; Nrf2/ARE pathways; Antioxidant

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.015

杨雷，硕士研究生，研究方向：炎症性肠病的发病机制及治疗。E-mail: yanglei3054@163.com

沈磊，硕士生导师，主任医师，研究方向：炎症性肠病的发病机制及治疗。E-mail: leishenwuhan@126.com

R574.62

A

1006-5709(2017)11-1255-03

2017-02-10