接骨木花青素的纯化工艺及清除DPPH自由基活性的研究

冯文娟,崔玮琪,徐泽平,2,陈晓慧,李超孟,董志荣,司文元,包 英

(1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司,山东 滨州 256500;2.滨州市环境微生物技术工程研究中心,山东 滨州 256500)

接骨木花青素的纯化工艺及清除DPPH自由基活性的研究

冯文娟1,崔玮琪1,徐泽平1,2,陈晓慧1,李超孟1,董志荣1,司文元1,包 英1

(1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司,山东 滨州 256500;2.滨州市环境微生物技术工程研究中心,山东 滨州 256500)

通过乙醇浸提法从接骨木鲜果和干果中提取花青素,通过膜分离技术、正己烷萃取、大孔吸附树脂纯化,从接骨木鲜果和干果中提取得到的花青素冻干粉得率分别为0.43%和1.52%,花青素含量可以达到29.32%。接骨木花青素在质量浓度为200 μg/mL时,DPPH自由基的清除率最高为89.40%,相当于维生素C的96.28%。结果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

接骨木;花青素;大孔吸附树脂;DPPH自由基

接骨木(Sambucus williamsiiHance),也叫公道老、扦扦活、大接骨丹等,在医学领域的应用较为广泛[1-2],对接骨木的研究主要集中在接骨木化学成分及总黄酮提取分离及抗氧化活性[3-4],接骨木茎枝叶及果实花青素成分分离及药理活性[5-6]。花青素(anthocyanidin)是一种天然水溶性色素,易溶于水、甲醇、乙醇、稀碱与稀酸等极性溶剂中,具有抗氧化、抑菌、预防心血管疾病等功效[7-9],在食品、化妆品、医药领域的应用前景很好,花青素主要来源有黑豆、紫葡萄皮、蓝莓、紫薯等[10-12],但是这些资源有限,因此开发花青素含量高的资源的意义重大。树脂吸附法是利用大孔吸附树脂吸附溶液中的有机物,再经一定溶剂将其洗脱下来,从而达到分离、纯化、除杂等目的,由于其纯化效果佳,对设备要求低,已经广泛用于天然活性成分的分离纯化,如大孔树脂纯化花青素、多糖等[13]。本研究以接骨木鲜果和干果为原料,采用乙醇溶剂法提取接骨木花青素,结合大孔吸附树脂层析和真空冷冻干燥技术对花青素进行分离纯化,并对其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力进行考察,探讨其抗氧化能力,希望为接骨木花青素的产业化生产和产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

接骨木果:山东博华生态农业有限公司;标准品葡聚糖(平均分子质量5 900 Da、1.18×104Da、4.75×104Da、11.2×104Da、21.2×104Da、40.4×104Da):美国 Sigma 公司;维生素C(vitaminC,VC):天津市科密欧化学试剂有限公司;大孔吸附树脂AB-8:天津南开和成科技有限公司;0.45 μm滤膜:上海安谱科学仪器有限公司;1 kDa的超滤膜:天津膜天膜科技股份有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DL-6M型大型低速离心机:长沙湘仪离心机科技有限公司;LC-10AT高效液相色谱仪、UV-1700型紫外可见分光光度计:日本岛津公司;FD-ID-55型真空冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司;PHS-3C型pH计:上海今迈生物科技有限公司;RE-5286A型旋转蒸发仪:上海雅荣生化设备仪器有限公司;FA2004型电子天平:上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素的提取

接骨木鲜果去除枝叶,准确称取1 kg加入到1 L体积分数为95%乙醇溶液(浓盐酸调节pH 2～4)中室温浸提4 h,4层纱布过滤,滤渣再次重复提取一遍,合并两次滤液,离心,上清液于60℃条件下真空蒸发,获得花青素浓缩液。

接骨木干果去除枝条,准确称取200 g加入到1 L体积分数为95%乙醇溶液(浓盐酸调节pH2～4)中室温浸提48h,4层纱布过滤,滤渣再次重复提取一遍,合并两次滤液,离心,上清液于60℃条件下真空蒸发,获得花青素浓缩液。

1.3.2 接骨木粗多糖的提取

按照1.3.1的方法提取得到花青素浓缩液,加入5倍体积的无水乙醇进行醇沉,抽滤,滤渣60℃烘干即得接骨木粗多糖。将滤液旋转蒸发除去乙醇,经冷冻干燥即得接骨木花青素。接骨木多糖可以说是存在于接骨木花青素提取过程中的一种杂质,影响花青素的品质。

1.3.3 总糖的测定

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[14]。以葡萄糖质量(X)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线,结果见图1。由图1得到标准曲线线性回归方程为:A=7.2208X+0.000 9,相关系数R2=0.999 9,表明二者线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.4 多糖分子质量的测定

(1)色谱条件

两根Shodex Ohpak SB-803HQ凝胶色谱柱(8.0 mm×300mm)串连。检测器:示差折光检测器;流动相:0.02%叠氮化钠水溶液;流速:0.5 mL/min;柱温:35℃;进样量:20 μL。

(2)标准溶液及接骨木多糖溶液的配制

准确称取0.050 0 g葡聚糖标准品,加流动相溶解定容至10 mL,配制成5.0 mg/mL的标准品溶液,用0.45 μm水系微孔滤膜过滤即得。

准确称取1.00g接骨木粗多糖,加流动相溶解配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液,用0.45 μm水系微孔滤膜过滤即得接骨木多糖溶液。

(3)标准曲线的制备

分别吸取葡聚糖标准溶液20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图及保留时间,以保留时间为横坐标,以重均相对分子质量的对数(logMw)为纵坐标绘制葡聚糖标准曲线。

1.3.5 大孔吸附树脂纯化花青素

(1)树脂预处理

大孔吸附树脂AB-8先用2倍体积的无水乙醇浸泡过夜,过滤除醇,蒸馏水清洗直至洗脱液澄清为止。再用2倍体积的4%盐酸溶液浸泡3 h,过滤,蒸馏水清洗,直至洗脱液呈中性。用2倍体积的5%氢氧化钠溶液浸泡3 h,过滤,蒸馏水清洗,直至洗脱液呈中性。

(2)接骨木花青素分离纯化工艺

[15],将预处理好的大孔吸附树脂装入层析柱,连续加入按照1.3.1方法提取的接骨木花青素浓缩液以10mL/min流速进行吸附,直到层析柱最下面的树脂变红或变黄即为吸附完成。吸附完成后,用5倍柱体积的蒸馏水洗脱,再用3倍柱体积的35%的乙醇溶液洗脱,收集水洗脱液和醇洗脱液,60℃条件下真空浓缩,-40～50℃冷冻干燥48 h,醇洗脱下来的花青素即为纯化后的花青素。

经上述乙醇提取,过滤,离心,提取液浓缩,获得花青素浓缩液,1份用0.5倍体积的乙酸乙酯萃取油脂12 h,收集下层脱脂液体;1份用0.5倍体积的正己烷萃取油脂12 h,收集下层脱脂液体;另一份不做脱脂处理。将这3份提取液用大孔吸附树脂纯化,分别收集醇洗脱液,在60℃条件下真空浓缩,-40～50℃冷冻干燥48 h得到接骨木花青素冻干粉。1.3.6花青素含量的测定

采用pH示差法。参考文献[16],将接骨木鲜果和干果提取的花青素冻干粉分别配制成质量浓度为0.10 mg/mL和2.0 mg/mL的溶液,取两份各1 mL于试管中,分别加4 mL pH=1.0的14.90 g/L氯化钾缓冲液和pH=4.5的16.40 g/L乙酸钠缓冲液(用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH值),室温放置80min,在波长520nm和700nm处测定吸光度值。花青素含量计算公式如下:

A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5

式中:A为吸光度值;449.2为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的相对分子质量;N为稀释倍数;V为定容体积,mL;29 600为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数;L为光程,1 cm;M为取样量,g。

1.3.7 花青素紫外可见光光谱扫描

将接骨木花青素分别用pH 1.0的氯化钾缓冲液和pH 4.5的乙酸钠缓冲液配制成0.1 mg/mL的溶液,在波长250～700 nm波长紫外可见光光谱范围内扫描。

1.3.8 清除DPPH自由基能力

准确称取0.100 0 g花青素冻干粉配成0.10 mg/mL的花青素母溶液,再用蒸馏水稀释成200 μg/mL、100 μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL的花青素待测液。以相同质量浓度的维生素C作为阳性对照。

测定方法参考文献[17-18],取待测液2.0mL加入2.0mL的2×10-4mol/LDPPH乙醇溶液混匀,以无水乙醇为空白对照,避光反应30 min,在波长517 nm处测定吸光度值,记为A1;取待测液2.0mL加入2.0mL的无水乙醇,混匀,避光反应30min,在波长517nm处测定吸光度值,记为A2;取2.0mL的2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液加入2.0 mL的无水乙醇,混匀,避光反应30 min,在波长517nm处测定吸光度值,记为A3。清除DPPH自由基能力计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 多糖分子质量的测定

以保留时间(x)为横坐标,以葡聚糖重均相对分子质量对数(y)为纵坐标,绘制葡聚糖标准曲线,结果见图2。由图2可知,得到葡聚糖标准曲线线性方程y=-0.251 4x+11.486,拟合系数R2=0.997,说明保留时间和重均相对分子质量的对数呈良好的线性关系。

图2 葡聚糖分子质量标准曲线Fig.2 Standard curve of molecular mass of dextran

10 mg/mL的接骨木多糖溶液经过高效液相色谱仪分析检测,将保留时间带入葡聚糖标准曲线线性方程得到接骨木多糖的相对分子质量,结果见表1。

表1 接骨木多糖分子质量测定结果Table 1 Determination results of molecular mass of polysaccharide fromS.williamsii

本研究检测接骨木粗多糖中总糖含量为9.69%。通过测定接骨木多糖分子质量的分布,选择合适的超滤膜来除掉接骨木多糖。由表1可知,接骨木多糖的分子质量有82.24%分布在1 000 Da以上,因此采用1 000 Da的膜不仅可以将接骨木提取物中的大部分多糖除掉,还可以除掉接骨木提取物中其他大分子物质,从而起到纯化花青素的效果。

2.2 花青素的分离纯化

以未经过大孔吸附树脂纯化处理为空白对照,检测接骨木花青素冻干粉中花青素含量,结果见图3。

图3 不同处理对花青素含量的影响Fig.3 Effects of different treatments on the content of anthocyanidin

以接骨木鲜果和干果为原料得到的花青素冻干粉花青素得率分别为0.43%和1.52%。由图3可知,大孔吸附树脂AB-8对花青素具有很好的吸附除杂作用。纯化后的花青素冻干粉中花青素含量可以达到27.74%,比未纯化的花青素纯度提高了27.27个百分点。水洗脱下来的花青素冻干粉中花青素含量较低,为3.65%,可以收集后再次用大孔吸附树脂进行纯化。以鲜果为原料经大孔吸附树脂纯化后的花青素冻干粉中花青素含量显著高于干果的,因此选择接骨木鲜果为原料进行下面的实验。

2.3 有机溶剂萃取

检测接骨木花青素冻干粉中花青素含量,结果见图4。

图4 脱脂处理对花青素含量的影响Fig.4 Effect of degreasing treatment on the content of anthocyanidin

未经过脱脂处理的花青素浓缩液中含有大量的油脂,直接使用大孔吸附树脂进行纯化,不仅影响花青素的质量,而且会降低大孔吸附树脂的使用寿命,因此,在大孔树脂纯化之前,有必要去除花青素浓缩液中的油脂。采用有机溶剂萃取法,由图4可知,经正己烷脱脂和大孔吸附树脂纯化后得到的花青素冻干粉中花青素含量为29.32%,均显著高于未脱脂和乙酸乙酯脱脂处理组,并且乙酸乙酯能够溶解于水中,正己烷不溶于水,因此选择正己烷作为去除油脂的有机溶剂。

2.4 接骨木花青素紫外可见光光谱扫描

图5 接骨木花青素的UV-vis光谱扫描曲线Fig.5 UV-vis spectral scanning curve of anthocyanidin from S.williamsii

由图5可知,接骨木花青素在波长520nm和280nm处有最大吸收峰,这与参考文献[15]的研究中矢车菊花素-3-O-葡萄糖苷标准品的光谱扫描结果一致,矢车菊花素-3-O-葡萄糖苷是众多花青素中的一种,可以初步说明从接骨木果实中提取出来的物质中含有矢车菊花素-3-O-葡萄糖苷。

2.5 清除DPPH自由基能力

图6 接骨木花青素对DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of anthocyanidin fromS.williamsii on DPPH free radical

由图6可知,接骨木花青素对DPPH自由基具有一定的清除能力,随着花青素质量浓度的增大,DPPH自由基清除率增大,在花青素质量浓度为200 μg/mL时,DPPH自由基的清除率最高为89.40%,相当于VC的96.28%。结果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

3 结论

通过接骨木糖分子质量的分析,82.24%的接骨木糖的分子质量分布在1 000 Da以上,可采用1 000 Da的超滤膜除掉接骨木提取物中的大部分糖来纯化花青素。

与乙酸乙酯相比,正己烷能够更加有效的去除接骨木提取液中的油脂,提高花青素的纯度,延长大孔吸附树脂的寿命。大孔吸附树脂AB-8能够很好的纯化接骨木花青素,经正己烷脱脂和大孔吸附树脂纯化后得到的花青素冻干粉中花青素含量可以达到29.32%,比未纯化的花青素纯度提高了28.85个百分点。

接骨木花青素对DPPH自由基具有一定的清除能力,在花青素质量浓度为200 μg/mL时,DPPH自由基的清除率最高为89.40%,相当于VC的96.28%。结果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

本研究的膜分离技术、正己烷萃取脱脂和大孔吸附树脂纯化,可以显著提高接骨木花青素的纯度,希望为接骨木花青素的工业化生产提供理论依据。

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FENG Wenjuan1,CUI Weiqi1,XU Zeping1,2,CHEN Xiaohui1,LI Chaomeng1,DONG Zhirong1,SI Wenyuan1,BAO Ying1
(1.Yellow River Delta Jingbo Research Institute of Chemical Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256500,China;2.Binzhou Environmental Microbial Technology and Engineering Research Center,Binzhou 256500,China)

TS255.1

0254-5071(2017)11-0134-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.029

2017-08-24

山东省科技重大专项(2015ZDJS03003)

冯文娟(1986-),女,工程师,硕士,研究方向为农产深加工。