14种中药乙醇提取物对大肠杆菌的体外抑菌试验

南苹瑶，王小莺

（江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045）

14种中药乙醇提取物对大肠杆菌的体外抑菌试验

南苹瑶，王小莺*

（江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045）

目的：丁香等14味中药对大肠埃希菌ATCC25922的体外抑菌试验。方法：选用14种中药（白芍、乌梅、苦参、蒲公英、丁香、黄连、山楂、黄柏、大黄、连翘、柴胡、穿心莲、郁金、白芷），分别采用乙醇回流法制备出生药浓度为1g/L。前4种中药提取出膏状物全部用无水乙醇溶解，后10种中药精密称取两份分别用无水乙醇、70%乙醇溶解，通过琼脂打洞法测定不同中药对大肠杆菌的抑制作用。结果：连翘、柴胡、穿心莲、郁金、白芷的中药提取物对大肠杆菌几乎没有抑菌作用，白芍、乌梅、苦参、蒲公英的中药提取物用无水乙醇溶解在琼脂打洞法中平均抑菌圈分别为17.7mm、26.0mm、16.7mm、12.0mm，丁香、黄连、山楂、黄柏、大黄的中药提取物用无水乙醇溶解对大肠杆菌的平均抑菌圈为17.0mm、10.5mm、21.5mm、15.5mm、17.5mm；用70%乙醇溶解所测平均抑菌圈分别为21.5mm、23.5mm、23.0mm、21.5mm、21.5mm。结论：9种中药的乙醇提取物对大肠杆菌的体外抑菌强度大小为乌梅＞山楂＞白芍＞大黄＞丁香＞苦参＞黄柏＞蒲公英＞黄连；中药膏状物提取物用70%乙醇溶解可以获得更大的抑菌圈，说明溶解于水中的中药提取物也含有抑菌成分不容忽视。

中药；大肠杆菌；乙醇提取；琼脂打洞法

在人和家畜的生活环境中存在着各种细菌，而长期使用化学药物会导致药物毒副作用、细菌耐药性、药物残留所致的畜产品安全等问题，且抗生素渐渐不能满足畜产品无公害化生产的要求。而中草药是我国特有的中医药理论和实践的产物，价格低廉，药源广泛，具有广泛的发展潜力，它主要是通过调整机体功能状态来实现抗菌作用[1]。大部分中草药具有毒副作用小、无残留、无耐药性的特点[2]，中药作为替代化学药物解决药残和抗药性的重要途径，越来越受到重视。为了寻求抗菌作用强的药物，我们对十四种中药进行了体外抑菌试验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

药材：选用白芍、乌梅、苦参、蒲公英、丁香、黄连、山楂、黄柏、大黄、连翘、柴胡、穿心莲、郁金、白芷14种中药，均购于江西农业大学医院。

菌种：大肠埃希菌ATCC25922购于广东省微生物菌种保藏中心。

仪器与设备：旋转蒸发器（RE5298A,上海亚荣生化仪器厂）；粉碎机(DFT-100，温岭市林大机械有限公司)；双人单面净化工作台（SW-CJ-2D,苏州净化设备有限公司）；生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS,上海申安医疗器械厂）；数显恒温水浴锅（HH-4，国华电器有限公司）；移液枪。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

麦康凯琼脂培养基：取麦康凯琼脂粉末12.5g，加入装有250mL蒸馏水的锥形瓶中，加热煮沸溶解并搅拌，121℃高温灭菌20min后备用。未冷却凝固时分别倒入12个灭菌干燥的培养皿中，等待琼脂冷却凝固。冷却后4℃冷藏备用。

MH肉汤培养液：MH肉汤粉末7.5g，加入装有250mL蒸馏水的锥形瓶中加热煮沸溶解并搅拌，121℃高温灭菌20min后备用。冷却后4℃冷藏备用。

1.2.2 菌液的制备

取冷冻保存的塑料冻存管，立即放置在38～40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰完全溶解为止，一般约50～100s，开启塑料冻存管，吸取菌液移植于麦康凯琼脂培养基上，37℃恒温培养18～24h。挑取该麦康凯琼脂培养基上的单个菌落接种至另一麦康凯琼脂培养基上进行菌种复苏。采用平板计数法进行细菌计数，勾取平板上菌落1～2个，置于MH肉汤中，37℃恒温振荡培养至对数生长期后进行细菌计数。菌液4℃冰箱保存备用，临用前稀释为106CFU·mL-1。

1.2.3 中药提取物的制备

1.2.3.1 白芍、乌梅、苦参、蒲公英药材各称取10g，粉粹成粉末，70%乙醇加热回流提取，合并提取液。取滤渣后，50～60℃下旋转蒸发至膏状物[3]，用无水乙醇以生药浓度为1g/L在超声波下溶解配成药液。过滤除菌，置冰箱4℃冷藏保存。

1.2.3.2 丁香、黄连、山楂、黄柏、大黄、连翘、柴胡、穿心莲、郁金、白芷药材各称取10g，分别粉粹成粉末，70%乙醇加热回流提取，合并滤液，精密量取2份分别用无水乙醇、70%乙醇溶解，生药浓度为1g/L。过滤除菌，置冰箱4℃冷藏保存。

1.3 体外抑菌试验

根据李敏珍等人的研究[4]，选用琼脂打洞法做体外抑菌，拿灭菌棉签将菌液均匀涂抹在平板上，室温干燥5min后，用无菌打孔器打孔，以无菌针头挑出孔内琼脂。滴少量的未凝固的琼脂于孔内封底，防止药液从孔底流走。以无水乙醇为溶剂对照，每个孔滴药液100μL，重复2或3次，放置30min后，37℃培养箱中培养18～24h后观察抑菌圈大小，求平均值。

1.4 结果判定标准

打孔法：抑菌圈直径≥20mm为极敏，抑菌圈直径在15～19mm为高敏，抑菌圈直径在10～14为中敏，抑菌圈直径＜10mm为低敏，无抑菌圈为耐药[5]。

2 结果与分析

2.1 无水乙醇溶解中药提取物体外抑菌试验

白芍、乌梅、苦参、蒲公英乙醇提取物对大肠杆菌均有抑制作用，所测的平均抑菌圈大小分别为 17.7mm、26.0mm、16.7mm、12.0mm，其中乌梅的抑菌作用最强，为极度敏感，蒲公英的抑菌作用最差，为中度敏感。结果见表1。

表1 无水乙醇溶解中药提取物体外抑菌试验结果

图1

2.2 不同浓度乙醇溶解中药提取物体外抑菌试验

连翘、柴胡、穿心莲、郁金、白芷的中药提取物对大肠杆菌几乎没有抑制作用，根据判定标准，表现为耐药。

由表2得知，对于丁香、黄连、山楂、黄柏、大黄的中药提取的膏状物分别用无水乙醇和70%乙醇溶解，用70%乙醇溶解的所测的平均抑菌圈均更大。其中黄连相差最大，山楂差距最相近，均为极度敏感。说明溶解于水中的中药提取物也有抑菌成分，且那部分抑菌成分对于不同中药，其抑菌效果又是不同的。结合前四种中药，同样的生药浓度1g/L，相同的用量每个孔100μL，9种中药对大肠杆菌的抑制强度大小为乌梅＞山楂＞白芍＞大黄＞丁香＞苦参＞黄柏＞蒲公英＞黄连，用70%乙醇溶解中药提取物抑菌强度大小为山楂＞大黄＞丁香＞黄柏＞黄连。

表2 不同浓度乙醇溶解中药提取物体外抑菌试验结果

图2

3 讨论

不同中药对大肠杆菌的抑制作用不同，而将中药有效抑菌成分更多地提取出来并发挥它的药效至关重要。对于不同的中药，提取有效成分、浓缩、溶解膏状物的条件不同，抑菌效果可能有很大不同。黄连与山楂提取出的膏状物精密称取两份分别用无水乙醇和70%乙醇溶解，配成的药液做琼脂扩散法测抑菌直径，70%乙醇溶解下两种药物抑菌圈大小相近，但无水乙醇溶解下两种药物抑菌圈相差较大。

中药不同于西药，中草药提取物可以消除大肠杆菌耐药性及耐药质粒，从而达到抑杀目的。耐药质粒是造成大肠杆菌耐药性的主要原因[6]。临床上使用中药进行治疗，可对抗菌药物耐药和敏感的大肠杆菌产生相同的治疗效果，这对于临床用药具有积极的指导意义[7]。

图1、2可以看出加乙醇的孔不规则，可能是无水乙醇出现渗透的原因导致，由于无菌操作台不平导致平板倒置不均匀，同样是加100μL溶液，部分孔溶液会渗出，或是无菌针头挑琼脂不均匀导致.但从图中可以明显看出，溶解中药膏状物用70%乙醇更为合适。

[1]刘荣欣,鲁改儒,郭吉勇.中药及其组方对大肠杆菌的体外抑菌试验[J].安徽农业科学,2011,04∶2265-2267.

[2]周琰冰,赵鑫荟,艾启俊.三种中草药对大肠杆菌的抑制作用及机理初探[J].中国农学通报,2014,21∶294-300.

[3]钱晶晶.凤尾草抑菌活性成分提取及其抑菌作用的初步研究[D].江西农业大学,2015.

[4]李敏珍,曹治金,刘碧凤，等.几种常用中药抑菌试验方法比较(摘要)[J].广西中医药,1985,06∶33.

[5]唐亮,刘翠艳,韩春杨,等.中药研究常用三种体外抑菌方法的比较[J].中国中医药科技,2011,05∶419-420.

[6]褚秀玲,苏建青,韦旭斌.中药抗大肠杆菌病研究进展[J].安徽农业科学,2008,21∶9093-9094+9114.

[7]胥洪灿,宋友文.12味中药及其复方对大肠杆菌的体外抑菌试验[J].四川畜牧兽医,2004,03∶24-25+28.

S853.74

B

1003-8655（2017）05-0006-03

江西省科技厅重点研发计划项目（20161BBF60088）

南苹瑶（1995-），女，山西省，硕士研究生，研究方向为兽医药理学及毒理学，E-mail:2280425155@qq.com.

王小莺（1969-），女，江西省，硕士，副教授，E-mail:wangxiaoying6969@126.com.