利用SSR标记检测棉铃种仁DNA鉴定杂交种纯度

付小琼，叶武威，彭军

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

利用SSR标记检测棉铃种仁DNA鉴定杂交种纯度

付小琼*，叶武威，彭军

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

利用棉铃种皮DNA和种仁DNA的差异，通过Simple sequence repeats(SSR)分子鉴定技术在棉花制种后期快速检测制种质量。筛选杂交种亲本间的多态性SSR引物，应用多态性引物鉴定棉铃种仁的指纹图谱，指纹图谱与种皮一致，表明该棉铃为自交铃；种仁图谱为共显性谱带，则该棉铃为杂交铃，计算杂交铃的比例得出杂交种的制种纯度。F2的图谱分离验证了遗传的分离规律，F2的个体间具有不同的指纹图谱，育种过程中的杂交后代的分子检测能加速育种进程。

棉花；棉铃；亲本；杂交种；纯度；DNA；SSR

在农业生产上，杂交种通常具有丰产、优质、抗逆性强等优点。棉花杂交种长势强，早发性好，产量高，也得到了广大棉农的认可。近年来，由于农村劳动力向城市转移，棉花制种用工越来越紧缺，用工价格也越来越高，杂交棉制种的质量问题突出，存在剥大花、漏制种等现象，杂交种纯度难以保证。由于杂交种F1制种成本太高，种业公司开始推广应用F2，一些杂交组合F2代仍有较大的杂种优势，在生产上有一定的利用价值。如果要利用F2，那么必须保证F1较高的纯度，对制种质量要求高。在常规的制种纯度检测中，制种公司只能在种子收获后抽样去海南加代检测纯度（田间检测），检测耗时长且异地种植受环境条件影响大，效果不理想，在时间上也影响种子的销售[1]。

近年来，有制种公司采用SSR(Simple sequence repeats)分子标记来检测种子纯度[2]，可以缩短检测时间，并且避免异地种植环境对植株表型的影响。制种公司先要以农户为单位收集种子，在播种期前完成种子纯度检测和销售，工作量大、批次多、时间紧。因此，作者探索了1种通过检测棉铃的种皮DNA和种仁DNA的SSR分子标记图谱确定杂交种纯度的方法。采用该方法，在收获前就能了解农户的制种质量，且能减少监管工作，降低成本。

1 材料与方法

1.1 材料

鄂杂棉10号购自湖北惠民农业科技有限公司，种植于中国农业科学院棉花研究所东场试验基地（河南省安阳县），自然授粉。成铃期取叶片和棉铃。瑞杂816的父本、母本及杂交种来自济南鑫瑞种业科技有限公司，种植于东场试验基地，生长期取叶片。瑞杂816棉铃取自济南鑫瑞种业科技有限公司的制种田。

1.2 方法

1.2.1 引物合成与试剂来源。SSR引物由上海生工合成，Taq酶、dNTPs等购自安阳科睿生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2.2 棉花基因组DNA的提取。叶片单株取样，种皮、种仁单粒取样，用莱驰MM301震荡研磨仪（德国）进行冷冻研磨。DNA提取参考付小琼等[2]的方法。

1.2.3 SSR-PCR扩增。PCR （Polymerase chain reaction）扩增体系：模板 DNA 1 μL，Buffer（含 MgCl2）1 μL，dNTPs（10 mmol·L－1）0.3 μL，正、反向引物（10 μmol·L－1）各 0.5 μL， Taq 酶（2.5 U·μL－1） 0.2 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反应程序：94℃预变性3min；94 ℃变性 30 s、56 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 45 s，共30个循环；94℃变性 1min、56℃退火 45 s、72℃延伸2min；扩增产物于4℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳。扩增产物采用质量分数8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。每个孔点样品 2 μL，200 V 电压 10 h。 固定 10min， 渗透 12min，显色 5min，倒入终止液，终止反应[3]。

1.2.5 SSR扩增谱带的定义。在2个亲本间存在多态性的引物 （表1），扩增亲本和杂交种后谱带分为3种。一般在同一引物扩增图谱中依最小扩增产物的相对分子质量大小来分类，当最小产物的相对分子质量相同时以次小产物的相对分子质量分类，依此类推。相对分子质量低的谱带类型记为1，相对分子质量高的谱带类型记为2，杂合共显带类型记为3[4]。

1.2.6 杂交棉制种纯度的计算。检测棉铃的种仁DNA指纹图谱与种皮DNA指纹图谱一致，该棉铃为自交铃；种仁DNA指纹图谱为共显带型且与种皮DNA指纹图谱不一致，该棉铃为杂交铃。

表1 10对SSR引物的核苷酸序列

2 结果与分析

2.1 棉铃种子种皮和种仁DNA的提取及F2代遗传分离的分子验证

鄂杂棉10号结铃后，从代表植株上随机取2个叶片和1个铃期大于30 d的棉铃。从该棉铃中随机取24个棉籽。分别剥取每个棉籽的种仁和其中的6个种皮，分别提取叶片、种皮和种仁的DNA，用表1中前8对SSR引物扩增。

鄂杂棉10号的棉铃种皮DNA扩增图谱与叶片DNA的图谱相同，而F2种仁DNA扩增图谱出现分离且不同种仁的指纹图谱不一致（图1），印证了杂交后代的遗传分离。

图1 鄂杂棉10号F1棉叶、F2种皮和种仁DNA的SSR扩增图谱

叶片DNA和种皮DNA均为带型3即表现共显带，是杂交F1的指纹图谱。24个种仁在8对引物扩增图谱中有3种带型，均表现分离。部分引物的扩增图谱见图1，各材料的图谱类型见表2。

表2 各样本的带型编码

24个种仁的指纹图谱均不相同，表明了F2的基因分离。F2不存在常识中的50%的杂交纯度，只是对于某一性状而言有50%杂合概率出现，对于多性状观察则几乎没有相同的植株。通过分子水平的检测，发现棉仁样品11、15和20在8对引物的扩增下，仅有1对引物表现杂合，其余均为纯合位点。可见，利用后代的分子检测结合田间表现，选择纯合个体，能够加快新品种育成。

2.2 瑞杂816田间制种质量的检测

2.2.1 亲本和杂交种引物筛选。用34对核心引物在瑞杂816的两亲本间进行多态性筛选，得到6对多态性引物，分别为NAU1186、NAU2026、NAU2274、CS62、NAU1103、NAU1233。利用 这 6对引物在父本、母本和F1中进行扩增，扩增图谱见图2，父本和母本读带为1或2，F1为共显带型，读为3。

图2 6对SSR引物在瑞杂816和亲本间的扩增图谱

2.2.2 田间取棉铃检测杂交种纯度。从瑞杂816的制种田中随机取20个铃期大于30 d的棉铃，每个棉铃中随机取4个种子，分别提取4个种仁和1个种皮的DNA，用上述的6对核心引物进行扩增。

从图3和表3可以看出，17个棉铃种皮与种仁带型均不相同，为杂交种，另外3个种子的种皮和种仁带型完全一致，为自交铃。此制种田中棉花自交铃的比例为15%，即制种纯度为85%。而一般要求制种纯度为90%以上，所以此制种田的制种质量不理想。

图3 引物NAU2026对瑞杂816制种田20个棉铃的检测结果

3 结论

本研究中鄂杂棉10号的F2种仁指纹图谱的分离，反映了F2棉株个体的不同。另外，父母本差异大的杂交种须慎用F2。与目前常用的田间和室内杂交种纯度检测方法相比，本方法具有如下优点：（1）可以提前2个月进行检测，为种子的销售赢得时间；（2）棉铃壳厚，不易散失水分，且比叶片易于保存，异地取样时氧化变质速率慢，便于携带，不需特殊的设备，可以在棉花制种后期到制种田间随机取棉铃，带回实验室后统一检测，快速方便；（3）对检测不合格的农户所制杂交种提前淘汰，省去采收、加工和运输的费用。这不仅可以约束制种商的作假行为，降低棉种公司的经营风险，同时可以省去部分监管环节，树立“谁制种谁负责”的理念，减少制种成本。

应用本方法的建议：①有亲本的指纹图谱时，只鉴定种仁的图谱就能鉴定杂交种的纯度。②无亲本的指纹图谱时，须同时提取种皮与种仁DNA，以种皮的图谱为参考，先少量检测，筛选多态性引物；然后用筛选到的多态性引物检测待测种仁的DNA。

表3 6对引物在瑞杂816棉铃种子的种皮和种仁DNA的扩增带型统计

[1]周大云，杨伟华，魏守军，等.棉种纯度和真实性3种鉴定方法简介[J].中国棉花，2015，42(8):5-7.

[2]付小琼，杨付新.利用SSR分子标记鉴定中棉所63的真实性和纯度[J].中国棉花，2016，43(2):17-20.

[3]张军，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微卫星标记的PAGE/银染快速检测[J].棉花学报，2000，12(5):267-269.

[4]付小琼.2011年黄河流域棉花区试对照种的SSR指纹图谱[J].中国棉花，2011，38(12):29-32. ●

Rapid Detection of Cotton Hybrid Purity by SSR Markers with Kernel DNA

Fu Xiaoqiong*,Ye Wuwei,Peng Jun

S562.03

A

1000-632X(2017)11-0028-05

10.11963/1000-632X.fxqfxq.20171103

2017-05-17

*通信作者：m13663726262@163.com

中央级公益性科研院所基本科研业务专项基金（1610162016018）