柯里拉京与DNA相互作用的光谱研究

申炳俊， 刘占伟, 刘荣娟, 张佳佳, 林晓倩, 田 坚, 金丽虹*

(1. 长春理工大学 清洁能源技术研究所， 吉林 长春 130022; 2. 长春理工大学 生命科学技术学院， 吉林 长春 130022)

柯里拉京与DNA相互作用的光谱研究

申炳俊1， 刘占伟2, 刘荣娟2, 张佳佳2, 林晓倩2, 田 坚1, 金丽虹2*

(1. 长春理工大学 清洁能源技术研究所， 吉林 长春 130022; 2. 长春理工大学 生命科学技术学院， 吉林 长春 130022)

在pH 7.4的生理条件下，以溴化乙锭(EB)作为荧光探针，利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、共振散射光谱法结合盐效应和DNA熔点(Tm)实验研究了柯里拉京(Cor)与小牛胸腺DNA分子之间的相互作用机制。实验结果表明，Cor静态猝灭DNA-EB体系的荧光。Cor与DNA作用后，其特征吸收峰强度发生减色效应；与DNA作用导致Cor在480.5 nm处的共振散射峰增强，并在330.2 nm处出现新共振散射峰。盐效应对Cor与DNA分子相互作用的影响较小。与Cor作用引起DNA的Tm值升高5.5 ℃。由此推断，Cor与DNA相互作用的主要方式为嵌插，两者间形成了超分子体系。通过计算获得Cor与DNA间结合常数(KA)为5.82×103L/mol (298 K)、2.47×104L/mol (310 K)，它们之间的作用为熵驱动的自发、吸热过程，疏水作用力是主要的非共价作用方式。

柯里拉京； 小牛胸腺DNA； 光谱学； 嵌插； 反应机理

1 引 言

柯里拉京(Corilagin，Cor)又名鞣云实精(或柯子次鞣素)，属于一种天然的多酚单宁酸类化合物，是叶下珠、老鹳草、蜜柑草、白三草等多种植物的有效成分。1951年，Schmidt等[1]率先从植物薄叶云实中分离得到Cor，但在随后的30多年里，人们并没有注意到Cor的药理活性。直到1985年，Kakiuchi等[2]偶然发现Cor对AMV逆转录酶有抑制作用，进而引发了人们对Cor药理活性的研究。药理学实验证明，Cor具有护肝、抗炎、抑制病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等药理活性，尤其在抗肿瘤、抗氧化方面药效良好[3-5]。研究表明，Cor对肝癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃腺癌、喉癌、鼻腔癌等多种人源或鼠源癌细胞具有很好的抑制作用[6-8]。Cor表现出的多种生物活性及优异的抗癌活性，使其具有重要药用价值和广阔市场前景。

DNA是基因表达的物质基础，亦是多种具有抗癌、抗病毒等活性的药物小分子在生物体内的主要靶点，药物小分子与DNA插入方式可能会抑制肿瘤细胞的复制，最终导致细胞凋亡或死亡[9]。因此，研究药物小分子与DNA间的作用机制，不仅有助于进一步了解其药物作用机制，还可为寻求新型高效低毒抗肿瘤药物提供导向。目前，有关Cor抗肿瘤分子机理研究，主要从诱导凋亡[7,10]、阻断细胞周期[6]、抑制肿瘤发生[2]及增强肿瘤化疗药物的药效等[11]方面开展。而从Cor与DNA相互作用机制方面研究Cor抗肿瘤机理还鲜见报道。

基于此，本文以Cor为研究对象，在生理条件(pH7.4，离子强度0.1mol/L)下，采用紫外-可见光谱法、荧光光谱法和共振散射光谱法等技术，结合离子强度和DNA熔点实验，从分子水平上探索Cor与DNA作用机理，揭示Cor对DNA结构的作用强度和影响程度，为在单分子水平上研究Cor抗肿瘤机理提供了重要实验依据。

2 实 验

2.1仪器和试剂

实验中使用的仪器主要有UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)、F-280荧光分光光度计(天津港东公司)、320pH计(上海梅特勒-托利多仪器公司)、DC-4006高精度恒温水浴(上海菁海仪器公司)和QL-901振荡器(江苏其林贝尔仪器公司)等。小牛胸腺DNA(Sigma公司)用pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液配成浓度为4.9×10-4mol/L DNA储备液。柯里拉京(Cor，成都普菲德公司)用无水乙醇配成浓度为1.0×10-4mol/L溶液。溴化乙锭(EB，Sigma公司)用二次蒸馏水配成浓度为3.0×10-5mol/L溶液。储备液置于4℃冰箱中保存。实验用水为二次去离子水，其他试剂均为分析纯。

2.2实验方法

2.2.1吸收光谱

取6支7mL比色管，分别加入600μL Cor溶液和不同体积的DNA溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至3mL，漩涡充分混合，在室温下作用30min后分析。以相应浓度的DNA溶液为参比液，扫描200～550nm范围内的Cor-DNA体系吸收光谱。以缓冲溶液为参比液，获得1.5×10-5mol/L DNA溶液吸收光谱。

2.2.2荧光光谱

在7mL比色管中加入DNA-EB(浓度比1∶8.3)溶液，充分混合后，在恒温水浴(298K,310K)中作用30min，完成EB与DNA的结合作用。向DNA-EB体系中依次加入不同体积的Cor溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容，获得Cor-DNA-EB三元体系。旋涡振荡后，继续在恒温水浴中作用30min，扫描荧光发射光谱。设定激发波长(λex)为488nm，激发(Eex)/发射狭缝(Eem)为10nm/5nm，发射波长范围为570～640nm。

2.2.3共振散射光谱测定

在同步扫描模式下，记录Cor和Cor-DNA体系共振散射光谱。设定Δλ=0(λem=λex)，激发/发射波长均为200～700nm，狭缝设定同荧光发射光谱。

2.2.4离子强度影响

向DNA-EB、Cor-DNA-EB两体系中分别加入不同体积的1.0mol/L的NaCl溶液，记录NaCl不同浓度时的荧光发射光谱，参数同前。

2.2.5DNA熔点影响

将DNA和DNA-Cor(浓度比1∶2.4)两体系放置于20～95℃下10min，迅速取出测量260nm处的吸光度。两体系参比液分别为缓冲溶液和相应浓度的Cor溶液，温度间隔为5℃。

3 结果与讨论

3.1紫外-可见吸收光谱法研究Cor与DNA的作用

1～6:cDNA=(0,2.9,5.1,11.0,16.0,22.0)×10-6mol/L,cCor=2.0×10-5mol/L,7:cDNA=1.5×10-5mol/L

图1DNA浓度对Cor的紫外-可见吸收光谱的影响

Fig.1Effect of the concentration of DNA on UV-Vis spectra of Cor

3.2荧光光谱法研究Cor与DNA的作用

Cor无荧光特性，而DNA的荧光很弱，因此无法通过测定Cor或DNA的内源荧光来获得它们之间的相互作用信息。溴化乙锭(EB)是一种荧光染色剂，在水中荧光很弱。当EB菲锭环平行地插入到DNA双螺旋碱基对之间区域后，其荧光强度大大增加，因而EB是DNA嵌入结合常用的荧光探剂[14]。以488nm为激发波长，测得DNA-EB体系荧光发射峰位于601nm处，如图2所示。浓度逐渐增加的Cor引起DNA-EB体系荧光发射峰强度逐渐降低，而对峰位和峰形几乎没有影响。这说明Cor能够猝灭DNA-EB体系的荧光，Cor与EB竞争和DNA结合，嵌入到DNA中的EB逐渐被Cor置换出来，进而导致DNA-EB体系荧光减弱。因此，可以推断Cor以嵌入方式与DNA发生结合。

cDNA=1.5×10-5mol/L,cEB=1.8×10-6mol/L,1～10:cCor=(0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0,11.0,14.0,18.0,23.0)×10-6mol/L

图2Cor对DNA-EB体系的荧光光谱的影响

Fig.2Effects of Cor on the fluorescence spectra of EB-ctDNA(T=298K,λex=488nm)

3.2.1荧光猝灭方式及结合常数确定

Cor引起DNA-EB体系的荧光强度降低的原因主要有：(1) Cor与EB间发生了结合作用；(2) 嵌入到DNA中EB被Cor竞争从双螺旋结构中挤出，Cor与DNA间形成了复合物，产生静态猝灭；(3) Cor以动态猝灭方式引起DNA-EB体系荧光强度下降。为了明确Cor与EB间是否存在相互作用，文中进行了Cor猝灭EB荧光光谱实验，Cor的加入对EB荧光强度和发射峰位几乎没有影响，说明Cor与EB间没有结合作用。

无论是动态猝灭还是静态猝灭，其荧光强度均遵循Stern-Volmer方程[15]：

(1)

式中，F0、F分别为Cor加入前后DNA-EB体系的荧光强度；Kq为双分子碰撞过程的速率常数；τ0为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命(τ0≈1×10-8s)；[Q]为猝灭剂平衡浓度；KSV为Stern-Volmer猝灭常数。结果列于表1中。由表1可知，KSV值随温度的升高而降低，且Kq的数量级为1012，远大于2×1010L/ (mol·s)[16](最大碰撞速率常数)，说明Cor对DNA-EB荧光强度的猝灭过程为静态猝灭。

由Lineweacer-Burk双对数方程 (lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q])[17]求得结合常数KA和结合位点数n，结果列于表1。Cor与DNA-EB的KA数量级为103～104，说明结合力适中。另外，KA随温度升高而增大，表明Cor与DNA的结合过程为吸热反应。

表1 Cor与DNA-EB作用的猝灭常数KSV、结合常数KA、结合位点数n和热力学参数

3.2.2 热力学参数的测定

小分子与生物大分子间作用力属于分子间的弱相互作用，主要包括氢键作用力、范德华力、静电作用力和疏水作用等非共价键。根据结合过程的热力学参数(ΔH、ΔS和ΔG)大小和符号，可以判断小分子与生物大分子间的主要作用力类型[18]。

(2)

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS,

(3)

Cor与DNA-EB体系反应的热力学参数结果见表1。ΔH>0和ΔS>0表明Cor与DNA间非共价作用方式以疏水作用力为主，而ΔG<0和ΔH>0说明它们之间的相互过程为熵驱动的自发、吸热过程。

3.3 共振散射光谱法研究Cor与DNA的作用

在利用共振散射光谱(RLS)研究Cor-DNA体系共振光谱特性之前，先对Cor和DNA的RLS特征进行表征。不同浓度Cor的RLS见图3(a)。可以看出，Cor在372.1～400.0 nm范围内都存在RLS谱带，两个尖锐的RLS峰位于450 nm和481 nm。RLS强度均随Cor浓度的增加而逐渐变大，说明Cor浓度效应引起自聚集作用[19]。DNA溶液的RLS光谱见图3(b)中的曲线6。可以看出，DNA在364.7 nm处有RLS峰，其强度低于Cor，曲线较平缓。当Cor与DNA反应形成结合产物后，其RLS见图3(b)中曲线1～4。由图可知，Cor-DNA体系RLS强度随Cor浓度增加呈现出增大趋势，同时体系的RLS形状发生改变，在330 nm处出现了新的共振散射峰。当Cor浓度为4.0×10-6mol/L时，位于481 nm处的共振散射峰锐增。这是由于Cor以苯环结构嵌插到DNA碱基对后，由于Cor有不同程度的自聚集能力，可在DNA插入处表面完成自身聚集，成为超分子体系，使体系出现新的共振散射峰。另外，超分子体系的形成导致Cor-DNA体系体积变大，从而引起共振光散射增强。

(a) 1～4:cCor=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6mol/L. (b) 1～4:cCor=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6mol/L,cDNA=4.2×10-6mol/L; 5:cCor=1.0×10-6mol/L, 6:cDNA=4.2×10-6mol/L.

图3 Cor(a)和Cor-DNA(b)体系的共振散射强度

Fig.3 RLS intensity in different complex concentration of Cor(a) and Cor-DNA(b) (T=310 K,λex=λem)

3.4 盐效应实验

DNA的磷酸基骨架带有负电荷，很容易和带正电荷的离子产生静电作用。对于EB等嵌入到DNA内相邻的碱基对之间的小分子而言，由于受到相邻碱基对的保护，它对周围环境的改变并不敏感[12]。若小分子以静电作用模式与DNA结合，则增加的Na+势必会竞争与DNA结合，导致DNA磷酸骨架周围包裹Na+，进而阻止DNA与小分子的结合。不同浓度NaCl对DNA-EB和Cor-DNA-EB两体系荧光强度的影响结果见图4。由图可知，当Na+浓度为1.5×10-3mol/L时，DNA-EB和Cor-DNA-EB两体系的F0/F分别为1.030和1.034。即Na+增加导致DNA-EB和Cor-DNA-EB两体系荧光强度微弱降低(0.30%和0.34%)，但趋势相同。其原因在于，Na+等盐类阳离子能以静电方式与DNA的磷酸根作用，进而导致DNA磷酸骨架的静电斥力减小，DNA链结构紧缩。相对于紧缩DNA结构而言，生理条件下DNA结构则更有利于碱基堆积的形成。因此，嵌入到DNA相邻碱基对之间的EB和Cor，尽管受到上、下碱基对的保护对周围环境中的Na+改变不敏感，但逐渐增加的Na+仍导致DNA-EB和Cor-DNA-EB两体系荧光猝灭。由此可知，Cor与DNA间的结合不是静电结合或沟槽结合模式，而应该为嵌插结合。另外，当Na+浓度为1.0～1.5×10-3mol/L范围内时，DNA-EB和Cor-DNA-EB两体系的荧光强度趋于平衡。这是由于在该条件下，DNA磷酸根几乎完全被Na+中和，其DNA结构紧缩程度具有相似性。而在Na+浓度相同条件下，DNA-EB和Cor-DNA-EB两体系的荧光强度有所差别。这是由于EB三环平面基团和Cor苯环结构均以嵌入方式插入到DNA碱基对中，并形成有效堆积力，但其作用强度有所差别，Cor与DNA的碱基堆积力较EB略强。

图4 NaCl对DNA-EB和Cor-DNA-EB荧光强度的影响

Fig.4 Effects of NaCl on the fluorescence intensity of DNA-EB and Cor-DNA-EB system

3.5 熔点实验

小分子与DNA的相互作用能够影响DNA熔点 (Tm)。其中，嵌入式结合能够提高DNA双螺旋的稳定性，使Tm增加5～8 ℃，而非嵌入式结合一般对DNA的Tm影响不大[20]。以温度T为函数，绘制fss关于T的曲线(fss=ΔA′/ΔA=(A-A0)/(Af-A0))(A为表观吸光度，A0为起始吸光度，Af为最终吸光度)。fss=0.5时，熔点曲线对应的温度即为Tm。DNA和Cor-DNA熔解曲线见图5。由图可知，DNA的熔点为77 ℃，与Cor作用后DNA的Tm为82.5 ℃，即Tm增加了5.5 ℃。这再次表明，Cor与DNA发生了嵌插作用，该作用增加了DNA双螺旋结构的稳定性。

cDNA=3.7×10-5 mol/L, cCor=9.0×10-5 mol/L

Fig.5 Thermal melting curves for DNA in the absence and presence of corilagin

4 结 论

采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和共振散射光谱手段结合盐效应和熔点实验研究了Cor与小牛胸腺DNA的作用机制。在熵驱动下，Cor苯环结构能自发地嵌入到DNA碱基对中，碱基堆积是两者间结合的非共价作用方式，其作用强度适中。另外，Cor在DNA嵌入处聚集形成超分子体系，该过程为吸热反应。

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StudyonMechanismofInteractionsBetweenDNAandCorilaginbySpectroscopy

SHENBing-jun1,LIUZhan-wei2,LIURong-juan2,ZHANGJia-jia2,LINXiao-qian2,TIANJian1,JINLi-hong2*

(1.LaboratoryofCleanEnergyTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China;2.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China)

Under the physiological condition of pH7.4, using ethidium bromide (EB) as the fluorescent probe, the interaction mechanism between coriolis (Cor) and calf thymus DNA was studied by UV-Vis absorption spectroscopy, resonance scattering spectroscopy combined with salt effect and DNA melting point. Cor can quench the fluorescence of EB-DNA system through a static process. The subtractive effect of the characteristic absorption peak occurrs after Cor interacts with DNA. The interaction leads to the enhancement of Cor resonance at481nm and a new resonance scattering peak at330nm. The salt effect has a little influence on the interaction between Cor and DNA. The interaction leads to the increase of theTmof DNA by5.5℃. It is deduced that the main way of the interaction between Cor and DNA is intercalation, and a supramolecular system is formed between them. The binding constant (KA) between Cor and DNA is5.82×103L/mol (298K) and2.47×104L/mol (310K). The interaction between Cor and DNA is entropy-driven spontaneous, endothermic. Hydrophobic forces are the main non-covalent mode of action.

corilagin; calf thymus DNA; spectra method; intercalation; reaction mechanism

2017-04-24；

2017-07-24

国家自然科学基金(21153003)； 吉林省教育厅项目(201574)； 长春理工大学博士后基金(2014年,889)资助项目

Supported by National Natural Science Foundation of China (21153003); Project of Jilin Provincial Department of Education (201574); Postdoctoral Fund of Changchun University of Science and Technology (2014,889)

1000-7032(2017)12-1681-07

O657.3

A

10.3788/fgxb20173812.1681

*CorrespondingAuthor,E-mail:jinlh@cust.edu.cn

申炳俊(1977-)，男，吉林通化人，博士，助理研究员，2017年于长春理工大学获得博士学位，主要从事光谱分析理论与应用的研究。E-mail : bjshen@cust.edu.cn

金丽虹(1978-)，女，黑龙江富锦人，博士，副教授，硕士生导师，2011年于长春理工大学获得博士学位，主要从事物质相互作用、生物检测等的研究。E-mail : jinlh@cust.edu.cn