高通量测序分析miRNAs在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

曾文泓，王丽华，唐 丹

(1.江西中医药大学基础医学院，江西南昌 330004；2.江西中医药大学附属医院骨四科,江西南昌 330006；3.南昌大学第一附属医院老干科，江西南昌 330006)

·技术与方法·

高通量测序分析miRNAs在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

曾文泓1，王丽华2△，唐 丹3

(1.江西中医药大学基础医学院，江西南昌 330004；2.江西中医药大学附属医院骨四科,江西南昌 330006；3.南昌大学第一附属医院老干科，江西南昌 330006)

目的利用二代测序技术对FFPE标本进行高通量测序及相关的生物信息学分析，探讨miRNAs在来源于石蜡包埋胃癌组织(FFPE)中的标本检测的可靠性，探讨其临床意义。方法选取2015年和2016年2例胃癌患者手术切除同一组织的FFPE和新鲜冰冻标本，从标本中提取RNA并分离构建small RNA文库，采用Illumina测序平台测序的方法对其进行高通量测序，统计各已知miRNAs家族序列的表达量，构建已知miRNAs表达谱，对标本miRNAs进行Spearman相关性分析，评估miRNAs表达量的差异变化情况。结果新鲜冰冻标本中提取的总RNA质量较高，RNA保存度完整，显示28S是18S的1.3～1.4倍，从石蜡组中提取的RNA，结果显示有不同程度的降解，28S和18S的波峰不明显，miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中，Spearman相关系数分别为0.90和0.86，两者miRNAs表达量较一致，具有相关性。结论FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性，且可通过二代测序进行肿瘤标本检测。

胃肿瘤；miRNA；甲醛固定石蜡包埋；二代测序

胃癌是消化系统疾病中常见的恶性肿瘤之一[1]，最近大量的研究表明miRNAs在胃癌的发生、发展中起着重要的作用，参与着胃癌形成的多条信号通路，同时miRNAs被发现在肿瘤分期、分级、预后及药物的靶向治疗分析等方面具有巨大的潜力[2]。目前，新一代高通量测序已成为基因表达定量检测强有力的工具，特别是在定量低丰度的miRNAs研究及揭示微小的基因表达变化等领域有很大的优越性。为了研究miRNAs在来源于石蜡包埋胃癌组织标品检测的可靠性，本研究从FFPE标本中分离并构建small RNA文库，采用Illumina测序平台的边合成边测序的方法对其进行高通量测序，结合生物信息学，验证该方法的可行性，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取了江西中医药大学附属医院2015年和2016年2例胃癌患者的手术切除标本，手术标本经病理学检测分别由两位临床医师进行确诊，并采集相关病理资料。肿瘤位置以病理组织报告为准，肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移情况分别参照国际抗癌联盟标准(UICC)分类、WHO标准评判[3]。首先用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗取下的胃癌组织标本，把标本用组织剪剪切至0.5 mm左右大小，迅速放入液氮罐中进行冷冻待用(-80 ℃)，随后将余下部分用10%甲醛固定后石蜡包埋，归档存放于温室。取病理科石蜡包埋标本，无菌操作常规切片，切片厚度约10 μm，每2～3片放入1个1.5 mL的灭菌EP管中。

1.2方法

1.2.1RNA提取 于-80 ℃保存的新鲜标本在液氮中研磨至粉末状，加入Trizol试剂(Ambion，#AM12183555)混匀，按照Trizol试剂说明书提取总RNA。使用RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit(Ambion,#AM1975)处理甲醛固定石蜡包埋的标本，按照说明书进行核酸提取，在纯化柱上消化DNA后洗脱得到RNA。

1.2.2Small RNA文库的构建及测序 总RNA用15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，回收纯化18～30 nt的部分，在T4 RNA连接酶的作用下连接RNA Adapter，所得的产物经过RT-PCR扩增之后采用Illumina高通量测序平台进行测序。

1.2.3测序数据基本分析 Illumina测序平台的测序数据经过如下流程进行分析：(1)去除测序质量较低的序列，去除RNA Adapter污染的序列，去除没有目的片段的序列，去除包含polyA的序列和去除小于18 nt的小片段序列，得到高质量序列，对其进行长度分布统计。(2)将小RNA序列与基因组进行比对，将其定位到基因组，分析小RNA在基因组上的表达和分布情况。(3)将小RNA序列与GenBank数据库及Sanger中心的Rfam数据库中的ncRNA(非编码RNA)分别进行分析比对，去除rRNAs，scRNAs，snoRNAs，snRNAs和tRNAs。(4)将小RNA比对到mRNA的外显子和内含子，找出来自mRNA降解的片段。(5)将过滤后的序列进行互相比对，找出可以互补、符合siRNA结构特征的小RNA，作为可能的siRNA候选者。(6)通过与miRBase数据库中的所有人miRNAs进行比对分析，识别miRNAs序列。(7)统计各已知miRNAs家族序列的表达量，构建已知的miRNAs表达谱。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计学分析，将石蜡包埋的标本获得miRNAs表达量与新鲜组织获得的miRNAs进行Spearman相关性分析，评估miRNAs表达量的差异变化情况，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1RNA提取结果 临床手术切除组织标本的一般信息：2例胃癌患者的年龄分别为56和61岁，男1例，女1例。从两份标本经过检测提取的总RNA结果显示发现，保存在液氮组中提取的总RNA质量较高，RNA保存度完整，显示28S是18S的1.3～1.4倍，符合完整度要求28S是18S的1～2倍范围。从石蜡组中提取的RNA结果显示有不同程度的降解，28S和18S的波峰不明显，见图1。

2.2胃癌小RNA 分析胃癌FFPE标本和新鲜标本的miRNAs，用Illumina高通量测序平台对标本进行测序，并构建小RNA文库，去除接头并过滤低质量数据。结果小RNA序列长度分布在10～35 nt，其中22 nt的序列小RNA居多(图2)随后排除掉小于18 nt的序列后，得到了最终目标序列(表1)。将这些小RNA与Rfam、miRBase、GenBank,进行比对，同时将小RNA序列两两比对以寻找siRNA，最后进行了注释(表2)。

图1 Agilent 2100检测RNA质量

A：Frozen-1；B：FFPE-1；C：Frozen-2；D:FFPE-2

图2 小RNA长度分布图

表2 比较分别在-20 ℃保存和FFPE保存的小RNA检测结果[n(%)]

续表2 比较分别在-20 ℃保存和FFPE保存的小RNA检测结果[n(%)]

2.3高通量测序miRNAs表达谱 通过检测两对不同年份的同一胃癌组织冰冻标本和FFPE标本进行高通量测序，miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中，Spearman相关系数分别为0.90和0.86(图3)。

A:2015年；B:2016年

图3同一胃癌组织不同时间冰冻标本与FFPE标本中小RNA的Spearman相关分析

3 讨 论

miRNAs是临床医学研究中新兴的热点分子，参与疾病的信号通路，从而对疾病的发生、发展及治疗有重要作用[4]。从现阶段研究发现miRNAs可作为抑癌基因或者癌基因参与胃癌发展的某个阶段，它可与其他抑癌基因、癌基因及凋亡相关基因产生相互作用影响胃癌的进程。由于其多功能性特点使它在胃癌的标志物诊断和治疗方面有巨大的应用潜力，有利于提高胃癌的早期诊断率[5-6]。目前鉴定和确证肿瘤分子标志物需要大量的临床标本，而低温冰冻组织和FFPE组织标本是生物医学研究中重要和广泛的标本来源，很多医院病理科及医疗研究所都有大量的存档。从相关组织中提取RNA或者DNA来获得疾病相关的基因表达信息，进行疾病前瞻性、回顾性研究，鉴别不同疾病临床特征和预后转归有关的差异表达基因，筛选出作用的靶基因，分析疾病的调控机制路径等，这是目前研究相关疾病在分子水平的普遍做法，但经过甲醛固定处理过的石蜡包埋块标本经历了长时间的保存，其内部发生了核酸与蛋白质交联反应，单甲基化基团的修饰等，RNA不可避免地发生降解，对标本总RNA提取及下游逆转录和基因表达定量分析产生影响。

本研究发现提取冰冻组织和FFPE组织标本获得一定质量的RNA，可以达到进一步分子生物学检测的要求[7-9]。通过高通量测序2对不同年份的同一胃癌组织冰冻标本和FFPE标本，miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中，Spearman相关系数分别为0.90和0.86，两者miRNAs表达量较一致，具有相关性，研究还显示组织标本的RNA降解、片段化程度基于标本类型、保存期长短，以及固定、包埋和储存的条件而发生变化，同一胃癌组织不同保存年份中的冰冻组织标本和FFPE组织标本的RNA，冰冻组织中提取的总RNA质量比FFPE组织的要高，FFPE保存方法其RNA的降解程度比冰冻的要多，不同保存时间的冰冻标本RNA的降解会逐渐增加。FFPE标本中分离到的核酸比新鲜标本或冰冻标本的相对分子质量更低，石蜡组织标本提取的RNA通常会有一定的降解或甲醛修饰，而miRNAs分子的大小通常只有20～22 bt，自身片段短优势可以避免被修饰和酶的破坏降解[10]。由于活体细胞中miRNAs只有极少数处于游离状态，且可能miRNAs通过RNA诱导沉默复合体(RISC)靶向结合mRNA，发挥阻遏转录后翻译功能或降解RNA的作用，miRNAs受到RISC复合体的保护，所以石蜡组织中的大部分miRNAs未被修饰[11]，而在研究检测不同的临床标本中，具有高度的稳定性和重复性是作为有价值的肿瘤候选标志物的一个重要特点，因此选择miRNAs作为肿瘤候选标志物具有一定的临床意义[12]。本研究显示通过二代测序技术可以利用石蜡组织标本研究miRNAs在疾病中的作用，这为后期大样本肿瘤标志物研究筛选提供了很好的基础，可能为解决样本量不足及检测方案的选择提供帮助。

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HighthroughputsequencinganalysisofmiRNAsexpressioninfreshgastriccancertissuesandparaffinembeddedtissues*

ZengWenhong1,WangLihua2△,TangDan3

(1.SchoolofBasicMedicine,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330004,China;2.DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330006,China; 3.DepartmentforGeriatricDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330004,China)

ObjectiveTo analyze formalin-fixed and paraffin-embedded(FFPE) sample by next generation sequencing(NGS) technology for high throughput DNA sequencing and related bioinformatics analysis,and to explore the reliability and clinic significance of miRNAs in the detection of sample from FFPE gastric cancer tissue.MethodsFFPE and fresh frozen samples of the same tissue were excised from 2 cases of gastric cancer in 2015 and 2016.RNA was extracted from the samples and the small RNA library was isolated and constructed,and high throughput DNA sequencing was conducted with Illumina sequencing platform.The DNA sequencing results were analyzed by quantifying the expression of known miRNAs families sequence,and the expression profiling of known miRNAs was constructed.Spearman correlation analysis was performed on the miRNAs of the samples to assess the difference in the expression of miRNAs.ResultsThe total RNA extracted from the fresh frozen sample had higher quality and complete RNA coverage,and the results showed that the 28S was 1.3-1.4 times of 18S.The RNA extracted from the FFPE sample showed different degrees of degradation,and the peaks of 28S and 18S were not significant.The spearman correlation of miRNAs expression profiling in frozen and FFPE samples was 0.90 and 0.86 respectively,and the expression levels of miRNAs in two samples were consistent and had significant correlation.ConclusionmiRNAs in FFPE sample can retain certain level of integrity and can be used in tumor test by NGS.

gastric neoplasms; miRNAs; formalin-fixed and paraffin-embedded; next generation sequencing

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.025

江西省卫生计生委科技计划项目(20175539、20155389)。

曾文泓(1984-)，讲师，硕士，主要从事临床基础研究。△

，E-mail：89463632@qq.com。

R35

A

1671-8348(2017)32-4550-03

2017-04-20

2017-09-21)