响应面优化铁皮石斛须根多糖提取工艺研究

张水滔，李娜，徐娟，雷然，李云仙，刘祥义

（西南林业大学化学工程学院，云南昆明650224）

响应面优化铁皮石斛须根多糖提取工艺研究

张水滔，李娜，徐娟，雷然，李云仙，刘祥义*

（西南林业大学化学工程学院，云南昆明650224）

以铁皮石斛须根为原料，采用超声辅助技术提取多糖。在单因素试验的基础之上，利用响应面分析法中的Box-Behnken中心组合设计原理对料液比、提取时间、提取温度等工艺条件进行分析优化。结果表明：3个因素的影响大小为提取温度>料液比>提取时间，最佳提取工艺条件为料液比1∶29（g/mL），提取时间42 min，提取温度62℃，在此条件下多糖得率实际值为8.03%，与理论值8.14%差距较小。表明该回归模型合理有效，对石斛须根多糖提取工艺的优化有很好的指导作用。

铁皮石斛；多糖；超声辅助技术；响应面分析法

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimuraet Migo）是兰科石斛属植物，是一种药食同源植物，历代典籍奉其为“药中之上品”和“九大仙草之首”，具有增强体质、滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效[1-4]。铁皮石斛中含有多种化学成分，包括生物碱类、菲类、联苄类和氨基酸[5]、多糖类、芴酮类、倍半萜类、香豆素类及甾体糖苷类化合物，其中多糖类成分是铁皮石斛中具有免疫促进和抗肿瘤作用的活性成分[6-7]，具有较高的药理活性，还有防癌、抗癌、抗衰老的作用[8]，而且是铁皮石斛中含量最多的有效成分。铁皮石斛须根是其换茬时的产物，在生产中会出现大量的铁皮石斛须根，既没有综合利用，在堆放时还会产生污染。据报道，铁皮石斛全身是宝，本着二次资源综合利用的原则，充分开发铁皮石斛须根的潜在价值。

目前植物多糖的提取技术主要以水提醇沉法[9]，超声波协同复合酶法[10]、微波法[11]、超声波辅助水提法[12]、超临界流体萃取法[13]等。而超声波辅助水提法与许多传统提取方法相比，其优势之处在于：操作简便快速，提取效率高，速度快，工艺成本低，综合经济效益显著，媒质结构不被损坏等。超声波技术[14]可以产生强烈的空化效应、机械振动、高加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用，可以有效破坏植物细胞壁从而有利于多糖的提取。

本试验首先采用超声波辅助法提取铁皮石斛根中的多糖，然后再用苯酚-硫酸法[15]测定其中多糖的含量，再根据Box-Behnken响应面试验设计原理[16]设计并优化其提取工艺，为铁皮石斛的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛须根：采自云南瑞丽。

1.2 主要仪器及试剂

RE-2000型旋转蒸发仪：上海莱亚生化仪器厂；HH-2型电热恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；0408-1型低速台式离心机：上海医疗器械有限公司手术器械厂；AR224CN型分析天平：奥赛斯仪器有限公司；JJ-2型粉碎机：金坛市岸头良友实验仪器；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式多用真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；722型可见光分光光度计：天津冠泽科技有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；KH-500TDB型超声波清洗器：昆山禾创超声仪有限公司。

无水葡萄糖、氯仿、无水乙醇、石油醚、正丁醇、苯酚（以上试剂均为分析纯）、浓硫酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水：西南林业大学化学实验室自制。

1.3 标准曲线的绘制

根据文献[17]的方法，精确称取0.100 0 g干燥至恒重的无水葡萄糖，配制成浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。取 7 支试管，分别加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准溶液，加蒸馏水至总体积为2 mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，再加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，沸水浴煮沸15 min。冰浴中冷却后在490 nm处测量吸光度，以浓度和吸光度为横纵坐标绘制葡萄糖标准曲线如下图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

1.4 多糖的提取及其含量测定

1.4.1 样品预处理

将铁皮石斛须根洗净，55℃烘干，粉碎机粉碎后过40目筛，加入4倍体积的石油醚超声30 min进行脱脂处理，抽滤，滤渣55℃烘干至恒重备用。

1.4.2 工艺流程

精确称取1 g石油醚处理后的样品，加入一定体积的蒸馏水在一定的温度下超声辅助提取一定的时间。滤液浓缩，再加入95%乙醇，至乙醇浓度为80%，放置过夜，过滤，沉淀用适量蒸馏水溶解，采用Sevage法去除蛋白质，按照方法1.3测定吸光度，计算多糖得率。

1.5 提取工艺条件的优化

1.5.1 单因素试验

分别考察料液比、提取时间、提取温度3个因素对多糖得率的影响。

1.5.2 响应面试验设计

在单因素试验的基础之上，以料液比、提取时间、提取温度为因素，根据Box-Behnken设计原理，利用Box-Behnken组合设计试验方案优化提取工艺条件，并最终确定出最佳提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对多糖得率的影响

在温度为50℃的条件下，用超声波提取20 min，确定料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）对多糖得率的影响，结果如图2所示。

图2 料液比对多糖得率的影响Fig.2 Effect of feed liquid ratio on the yield of polysaccharides

由图2可知，料液比对多糖得率影响的效果较为明显，在 1 ∶10（g/mL）到 1 ∶30（g/mL）之间，多糖得率随着溶剂量的增加而增加，1∶30（g/mL）之后，随着溶剂的增加多糖得率有明显下降，所以较佳的料液比为1 ∶30（g/mL）。

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响

固定料液比为 1∶30（g/mL），提取温度为 50℃，考察超声提取时间 10、20、30、40、50 min 对多糖得率的影响，结果如下图3所示。

图3 时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of time on the yield of polysaccharides

由图3可知，随着超声提取时间的不断延长，其多糖的得率也在显著增加，在40 min时候达到最大值，之后多糖得率有所下降，可能原因是多糖在溶液中时间较长发生部分水解。因此较佳的提取时间为40 min。

2.1.3 提取温度对多糖得率的影响

选取料液比为1∶30（g/mL），超声提取时间为20 min，考察提取温度 40、50、60、70、80、90 ℃对多糖得率的影响，其结果如下图4所示。

图4 温度对多糖得率的影响Fig.4 Effect of temperature on yield of polysaccharides

由图4可知，温度较低时，多糖得率也比较低，随着温度的升高，多糖得率也不断增加，在60℃时多糖得率达到最大，此后有所下降，可能是温度多高多糖发生部分的水解。因此选取60℃为较佳水平进行下一步试验。

2.2 响应面试验设计结果

在单因素试验的基础之上，以多糖得率为响应值，根据Box-Behnken响应面试验设计原理，选取料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）3个因素进行响应面优化试验，试验因素与水平见表1，试验结果见表2。

2.3 响应面试验设计数据分析

响应面试验回归模型方差分析见表3。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface test

表2 响应面试验设计结果Table 2 Results of response surface design

表3 响应面试验回归模型方差分析Table 3 Variance Analysis of response surface regression model

由表3可知，通过数据分析得到该模型的决定系数R2=0.986 5，表明模型与实际试验值拟合度较高，具有可靠性，调整校正后系数为R2Adj=0.969 2，表明回归方程拟合度较好，可解释96.92%响应值的变化；失拟项的F值为3.04，P值为0.155 2>0.05，表明不存在未知因素可显著影响试验结果。根据Design expert8.0.6.1软件回归拟合后二次回归方程为：R=-57.722 5+0.454 87A+0.0865B+1.85738C-0.0001AB-0.000175AC+0.000 05BC-0.007 462 5A2-0.001 037 5B2-0.015 013C2。

根据回归方程可知：当A=29.47，B=41.76，C=61.75时，R出现极大值（R=8.14%），即当提取条件为料液比1∶29.47，超声提取时间41.76 min，提取温度61.75℃时，多糖得率达到最高，理论上为8.14%。根据响应面试验回归分析结果可得到等高线图及三维响应面图，如图5所示。

图5 各因素交互作用对多糖得率影响的等高线图和响应面图Fig.5 Contour plots and response surface plots of the interaction of various factors on the yield of polysaccharides

图5简明直观的反映了A、B、C各因素间交互作用对多糖得率的影响，由图5可知：因素C对多糖得率的影响最显著，表现为曲线最陡峭，其次是因素A，最后是因素B，与方差分析的结果一致，即3个因素的显著性大小为C>A>B（提取温度>料液比>提取时间）。

2.4 验证试验

为了简化试验，在提取条件为料液比1∶29（g/mL）、超声提取时间42 min、提取温度62℃时进行3次平行试验验证，得到多糖得率的平均值为8.03%，与理论试验结果非常相近，表明该回归模型合理有效。

3 结论

本试验应用超声波技术、单因素试验和响应面分析法优化了铁皮石斛须根的多糖提取工艺，得到二次回归方程为：R=-57.722 5+0.454 87A+0.086 5B+1.857 38C-0.000 1AB-0.000 175AC+0.000 05BC-0.007 462 5A2-0.001 037 5B2-0.015 013C2。确定出最佳提取工艺条件为料液比1∶29（g/mL），超声提取时间42 min，提取温度62℃，各因素的显著性水平为提取温度>料液比>提取时间，在此条件下多糖得率的理论值为8.14%，实际值为8.03%。因此，使用响应面分析法建立模型优化得到的最佳提取工艺参数具有准确度高和可行性好的优点，具有实际利用价值，可为铁皮石斛多糖及其多糖类产品的研究开发和综合利用提供理论依据。

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Optimization of Extraction Technique of Polysaccharides of Dendrobium Roots by Response Surface Methodology

ZHANG Shui-tao，LI Na，XU Juan，LEI Ran，LI Yun-xian，LIU Xiang-yi*
（School of Chemical Engineering，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan，China）

Dendrobium roots as raw material，the polysaccharide was extracted by ultrasonic assisted technique.On the basis of single factor experiment，the design principle of Box-Behnken center combination in response surface methodology（RSM）was applied to analyze and optimize the technological conditions such as liquid to liquid ratio，extraction time and extraction temperature.The results showed that the size of three factors as extraction temperature>solid-liquid ratio>extraction time，the optimal extraction conditions of solid-liquid ratio 1∶29（g/mL），extraction time 42 min，extraction temperature of 62℃，the rate of the actual value of 8.03%polysaccharides under this condition，the smaller the gap with the theoretical value of 8.14%.Showed that the regression model was reasonable and effective，to optimize the extraction process of polysaccharide of Dendrobium roots had very good guidance.

Dendrobium；polysaccharides；ultrasonic assisted technique；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.013

张水滔（1994—），男（汉），本科在读，应用化学专业。

*通信作者：刘祥义（1964—），男，教授，博士生导师，研究方向：天然产物开发与应用。

2017-05-22