硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)局部刺激性试验与溶血性试验

刘桂兰 ， 聂丽娜 ， 夏雪林 ， 刘爱玲 ， 王建锋 ， 邓旭明

(1.吉林大学动物医学学院 ， 吉林 长春 130062 ； 2.天津瑞普生物技术股份有限公司 ， 天津 东丽 300300)

硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)局部刺激性试验与溶血性试验

刘桂兰1,2， 聂丽娜2， 夏雪林2， 刘爱玲2， 王建锋1， 邓旭明1

(1.吉林大学动物医学学院 ， 吉林 长春 130062 ； 2.天津瑞普生物技术股份有限公司 ， 天津 东丽 300300)

头孢喹肟(Cefquinome)又名头孢喹诺、头孢喹咪、克百特。为动物专用的第4代头孢类抗生素，其抗菌谱广，抗菌活性强，对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌都有很强的杀灭作用[1]，在动物体内药动学特点良好，吸收快、达峰时间短、生物利用度较高[2]。由于其抗菌效果好，毒性低，残留低，安全性高，目前已被欧盟批准主要用于敏感菌引起牛、猪的呼吸道感染与奶牛的乳腺炎治疗[3]。为了科学评价硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)的安全性，参考国家食品药品监督管理局颁布的《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2014)[4]相关要求，分别进行皮肤刺激性试验、溶血性试验。预测临床用药的安全性，为进一步的临床试验提供参考。

1 皮肤刺激性试验

1.1 受试物名称 硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)由瑞普(天津)生物药业有限公司提供，规格：8 g/支；含头孢喹肟75 mg，批号：20110305。对照药物：制剂赋形剂，购自浙江田雨山药用油有限公司。

1.2 实验动物 大耳白兔8只，雌、雄各半，体重2 kg左右，购自天津实验动物中心。

1.3 试验方法 用同体左右侧自身对比法。

1.3.1 正常皮肤刺激性试验 选用大耳白家兔4只，试验前24 h在背部进行剃毛，去毛范围左、右各3 cm×3 cm。试验前观察暴露皮肤，无损伤皮肤方可进行试验。取硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)0.5 mL直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布(2.5 cm×2.5 cm)和一层玻璃纸覆盖，再用胶布加以固定；另一侧涂布注射用大豆油作为对照。贴敷时间至少4 h。贴敷结束后，除去受试物并用温水清洁给药部位。间隔8h，按上述方法再进行1次，连续4次。

1.3.2 破损皮肤刺激性试验 选用大耳白家兔4只，雌、雄各半，去毛方法同上，在用药部位划“井”字并以渗血为度。取硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)0.5 mL直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布(2.5 cm×2.5 cm)和一层玻璃纸覆盖，再用胶布加以固定；另一侧涂布制剂赋形剂大豆油作为对照。贴敷时间为4 h。贴敷结束后，除去受试物并用温水清洁给药部位。间隔8 h，按上述方法再进行1次，连续4次。

1.4 结果观察 在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按皮肤刺激反应评分标准(见表3)对皮肤红斑和水肿进行评分。

在每次去除药物后1 h以及再次贴敷前，观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后30～60 min，24、48h和72 h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况，代表性图片见图1、图2所示。皮肤观察结果见表1、表2。

图1 正常皮肤敷药第4次贴敷后72 h相连，表面光滑，质地柔软，易碎

图2 破损皮肤敷药第4次贴敷后72 h

1.5 结果评价 按表4进行刺激性强度评价。

1.6 试验结果评价 硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)对家兔的正常皮肤和破损皮肤均无刺激性。该试验系统与牛粘膜刺激反应相当。

2 溶血性试验-常规的体外试管法(肉眼观察法)

2.1 受试物名称 硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)由瑞普(天津)生物药业有限公司提供，规格：8 g/支；含头孢喹肟75 mg，批号：20110305。

2.2 实验动物 兔血约30 mL

2.3 试验方法

2.3.1 血细胞悬液的配制 取兔血约30 mL，放入

表1 正常皮肤刺激性试验结果

表2 破损皮肤刺激性试验结果

表3 皮肤刺激反应评分标准

表4 皮肤刺激强度评价标准

含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10 min，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1 000～1 500 r/min 离心15 min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2%的混悬液，供试验用。

2.3.2 受试物的制备 取硫酸头孢喹肟乳房注入剂用0.9%氯化钠溶液1∶3稀释后作为供试品溶液。

2.3.3 试验方法 取洁净试管7只，进行编号，1～5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按表5所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置 37±0.5 ℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15 min观察1次，1 h后，每隔1 h观察1次，观察3 h。按下列顺序加入各种溶液。

表5 溶血性试验操作过程

2.3.4 结果观察与判断 温育15、30、45、60、120、180 min后，对受试物管、阴性对照、阳性对照所有试管进行平行观察，含不同受试物的1～5号血细胞混悬液管、生理盐水阴性对照管均未发生溶血和凝聚，温育过程中血细胞逐渐下沉，上层液清晰、无色，下层为红色，无凝聚发生。含蒸馏水的阳性对照管溶液在30 min时，溶液上层呈澄明红色，不再是无色状态，说明有溶血发生，下层为红色；温育至120 min时，整体溶液呈澄明红色，与其他澄明无色的上层液有明显区别。由此判断阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生，受试物管中的溶液在3 h内未发生溶血和凝聚。

3 结果与讨论

本试验验证了硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)非口服给药途径的皮肤刺激性，选择大耳白家兔，用同体左右侧自身对比法，通过制剂对正常皮肤刺激性试验、破损皮肤刺激性试验，采用皮肤评分法进行评价，试验组皮肤均无红斑和水肿，皮肤刺激反应评分均为0分。取兔血，1∶3稀释硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)制剂后，分别按2%～10%不同比例加入2%红细胞悬液中，测定制剂可能引起的溶血可能性，结果表明，受试物红细胞混悬溶液在3 h内未发生溶血和凝聚。上述结果表明，硫酸头孢喹肟乳房注入剂(泌乳期)对家兔的皮肤无刺激性反应，无溶血性反应，提示本品的应用安全性良好。

局部刺激性与溶血性试验是针对药物的自身特点，对拟用于临床制剂的安全性评估，评估时将原料药删除后的制剂赋形剂作为对照，重点考察皮肤局部及周围相关部位的反应，有助于提示临床应用时可能出现的不良反应。药物整体的不良反应或安全性，还要结合药学、药效学、其他毒理学及临床应用信息，通过合理、客观的试验设计和研究，来最终确定，这些信息均对指导临床用药有重要价值。

[1] 陈杖榴.兽医药理学[M]. 3版. 北京：中国农业出版社, 2009.

[2] 杜向党，李新生，吴宁鹏，等. 头孢喹诺最新研究进展[J]. 中国畜牧兽医. 2006, 33(9):87-89.

[3] 王付民，陈杖榴.头孢喹诺的研究进展[J]. 动物医学进展. 2004, 25(4):50-53.

[4] 国家食品药品监督管理局(2014-05-03). 化学刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[EB/OL]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1616/101018.html.

2017-09-15

天津市现代农业产业技术体系创新团队建设专项(ITTCRS2017008)

刘桂兰(1975-)，女，高级畜牧师，博士生，从事兽药研发工作，E-mail:liuguilanever@163.com;聂丽娜(1983-)，女，助理工程师，硕士生，从事兽药制剂开发工件，E-mail:364608867@qq.com

注：聂丽娜和刘桂兰对本文具有同等贡献

刘爱玲，E-mail:liual@ringpu.com