miRNA在顶复门原虫感染中的作用机制

王臣荣 ， 许瑞勤 ， 王荣军 ， 张龙现

(河南农业大学牧医工程学院 ， 河南 郑州 450002)

miRNA在顶复门原虫感染中的作用机制

王臣荣 ， 许瑞勤 ， 王荣军 ， 张龙现

(河南农业大学牧医工程学院 ， 河南 郑州 450002)

顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫，如疟原虫、弓形虫和隐孢子虫，严重危害人类和动物的健康，而且给全球公共卫生和畜牧业带来巨大的经济损失。宿主通过启动免疫反应、凋亡及自噬等一系列细胞反应清除体内寄生原虫，而顶复门原虫也形成了多种机制逃避宿主的识别和清除，如干扰宿主一些重要信号通路、调节宿主细胞凋亡、细胞因子的产生、细胞周期及脂代谢等。宿主清除胞内寄生原虫和顶复门原虫逃避机制的能力主要是通过改变基因的表达实现的，研究表明，微小RNA(microRNA, miRNA)可以调控基因的表达。miRNA最早是在秀丽隐杆线虫中发现，随后越来越多的miRNA被发现。miRNA是一种长度为18～25个核苷酸(nt)的非编码RNA分子，通过与靶基因mRNA的3′端非编码区(3′untranslate region，3′UTR)结合，在翻译水平上抑制靶基因的表达。miRNA广泛存在于各种细胞质中且参与细胞的凋亡、炎症因子释放、细胞间信号传导和疾病的发生发展等。随着对miRNA研究的深入，miRNA被认为是宿主-病原体相互作用的关键调控者。因此本文对宿主/顶复门原虫miRNA在顶复门原虫(重点介绍疟原虫、弓形虫和隐孢子虫)感染中的作用机制做一综述。

1 宿主miRNA在顶复门原虫感染中的作用机制

研究表明，顶复门原虫(如疟原虫、弓形虫和隐孢子虫)感染会导致宿主细胞miRNA的改变[1-3]，然而宿主细胞miRNA的改变一方面由原虫为了更好的繁殖而引起[4-6]，另一方面是由宿主为了清除胞内的原虫引起[1,7-9]，然而宿主miRNA的这些作用机制尚未完全被揭示，因此本文从宿主miRNA调节宿主免疫反应、凋亡反应、改变宿主细胞特性和细胞周期及靶向虫体mRNA做一讨论。

1.1 宿主miRNA调节宿主对顶复门原虫的免疫反应 弓形虫和隐孢子虫都是机会性致病原虫，疟原虫虽然不是机会性致病原虫，但是机体免疫对疟原虫、弓形虫和隐孢子虫的清除至关重要。当机体免疫低下或者缺失时，弓形虫缓殖子变为速殖子，即由慢性感染到急性感染，而隐孢子虫会导致宿主出现致死性水泻，而且寄生部位可能由小肠扩大到胆管及肺部。研究表明，隐孢子虫感染的小肠上皮细胞分泌CXCL10和IL-18(IFN-γ诱导因子)，而IFN-γ在固有免疫和特异性免疫反应中都起着重要的作用。也有研究报道，小肠上皮细胞会分泌IFN-γ，分泌的IFN-γ会刺激巨噬细胞，进而产生NO抵抗隐孢子虫的感染。IFN-γ也可以激活NF-κB促进TNF-α的转录。在感染微小隐孢子虫的艾滋病人体内发现了高水平的特异性的IgG/IgA，表明B细胞产生的特异性抗体在抗隐孢子虫感染中可能不是必需的。综上，表明机体的固有免疫和特异免疫对抗隐孢子虫的感染非常重要。

研究发现，微小隐孢子虫感染导致人胆管上皮细胞let-7家族miRNA下调，引起其靶基因SNAP3、TLR4及SIRT1上调。微小隐孢子虫感染导致TLR4信号通路激活，进一步激活IKK2，然后使SNAP3磷酸化，而SNAP3磷酸化会导致含抗菌肽的外泌体释放，这些外泌体与微小隐孢子虫子孢子结合降低子孢子的生存能力和感染能力，SIRT1上调会抑制NF-κB的激活[8,10-11]，因此let-7家族的下调在调节宿主细胞免疫方面具有双向性。Zhou等[7]发现，微小隐孢子虫感染导致人胆管上皮细胞的miR-27b上调，引起其靶基因为KSRP下调，进而增加NO的产生来抵制隐孢子虫的感染，后又发现，人胆管上皮细胞miR-424和miR-503下调，进而导致其靶基因CX3CL1的上调来抵抗微小隐孢子虫的感染[12]。Gong等[13]发现，微小隐孢子虫感染导致人胆管上皮细胞的miR-221下调，导致其靶基因ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)上调，进而促进小肠上皮细胞与T淋巴细胞的相互作用。Cannella等[14]发现，小鼠的脑组织中发现由弓形虫分泌的ROP16引起miR-146a上调，而miR-146a会抑制IFN-γ的产生，进而有利于弓形虫的繁殖。Cai等[6]发现，弓形虫感染导致人巨噬细胞miR-17-92上调，而miR-17-92是调节Th1型反应的关键调控者，其中包括促进增殖、抑制凋亡、IFN-γ的产生和抑制T细胞分化[15]。

综上，表明宿主miRNA主要通过直接或间接调控抗菌分子、细胞因子、趋化因子、粘附分子和细胞外泌体等一系列分子来调节宿主对顶复门原虫的免疫反应，或者有利于宿主清除寄生原虫，或者有利于原虫的繁殖。

1.2 宿主miRNA调节宿主细胞的凋亡反应 研究表明，宿主细胞凋亡反应是抗寄生虫感染的一种经典策略，然而顶复亚门原虫也可以调节宿主细胞的凋亡，有利于自身的繁殖。通过微阵列技术分析微小隐孢子虫和人隐孢子虫感染HCT-8细胞早期的基因表达情况，发现由NF-κB调控的基因OPG(骨保护素)的上调，OPG阻止TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡配体)的促凋亡机制，抑制细胞凋亡有利于隐孢子虫早期的繁殖。Liu等[16]利用微小隐孢子虫感染HCT-8细胞，通过细胞核形态学观察及分子生物学，发现微小隐孢子虫感染早期HCT-8细胞的凋亡被抑制，感染后期促进细胞凋亡，可能前期抑制凋亡有利于微小隐孢子虫的繁殖，后期促进细胞凋亡有利于微小隐孢子虫的释放。

研究表明，不同感染阶段的原虫通过调控宿主miRNA间接调控宿主细胞凋亡[6,17-19]。微小隐孢子虫早期感染导致人胆管上皮细胞miR-513下调，其靶基因B7-H1上调，进而抑制感染的细胞凋亡，并促进未感染的细胞凋亡[17]，这可能是微小隐孢子虫躲避免疫清除的一个策略。弓形虫感染导致人巨噬细胞STAT3磷酸化进而引起miR-17-92的上调，导致其靶基因Bim的下调，进而抑制细胞的凋亡，有利于弓形虫的繁殖[6,18-19]。

1.3 宿主miRNA可能改变宿主细胞特性及细胞周期 研究表明，宿主细胞特性和细胞周期在顶复门原虫感染中也起着重要的调控作用。宿主为抵抗红内期疟原虫，正常的红细胞突变为镰刀形红细胞，第一可以增强单核细胞的吞噬能力，第二可以导致宿主肌动蛋白重构。通过改变红细胞的表面特性，如红内期疟原虫分泌恶性疟原虫红细胞表面蛋白-1(pfEMP-1)到红细胞表面，进而导致感染的红细胞特异的和内皮细胞的粘附，进而导致微循环局部堵塞导致炎症及缺氧等一系列病理现象。红细胞脱水或细胞密度的增加和红内期疟原虫的入侵有关。

研究表明，宿主miRNA可能改变宿主细胞周期。弓形虫感染L6细胞导致含有miRNA的外泌体释放，生物信息学分析这些外泌体miRNA参与细胞的繁殖和细胞周期，推测可能是由于这些外泌体miRNA抑制感染的细胞繁殖，增强未感染的细胞处在S期，而处在S期的细胞更有利于弓形虫的入侵[20]，可能S期的细胞可以更好地提供弓形虫的合成DNA所需的材料。

1.4 宿主miRNA靶向顶复门原虫mRNA 研究表明，宿主miRNA可以靶向病毒mRNA。宿主细胞miR-323，miR-491和miR-654能靶向A型流感病毒PB1基因进而抑制H1N1流感病毒在MDCK细胞中的复制。let-7c可靶向A型流感病毒M基因，进而抑制流感病毒在A549细胞内的增殖。

受到宿主miRNA可以靶向病毒的mRNA的启示，宿主miRNA或许可以靶向顶复门原虫的mRNA，进而抑制顶复门原虫的繁殖。疟原虫感染致红细胞let-7i、miR-451及miR-223上调，进而靶向抑制疟原虫PKA-R的表达，进而来抵抗疟原虫的感染[9]，这也说明了宿主细胞内的miRNA来源不局限于细胞核。病毒和顶复门原虫的入侵过程不一样，病毒将核酸注入细胞内，因此宿主细胞miRNA可以很容易靶向病毒的mRNA，而顶复门原虫会形成纳虫空泡并且原虫以二分裂方式繁殖，因此宿主miRNA进入顶复门原虫子孢子中非常困难，或许外泌体非编码RNA比较容易。因此须进一步验证宿主miRNA是否可以靶向顶复门原虫mRNA。

除上述作用机制外，宿主miRNA可能参与宿主细胞/顶复门原虫的自噬过程。研究表明，弓形虫和疟原虫体内存在自噬现象，当子孢子成功入侵宿主细胞后，不再需要参与子孢子粘附和入侵的细胞器，如微线体和棒状体，因此虫体会启动细胞自噬途径清除这些细胞器，以便获取的能量更多的用于裂殖生殖。非顶复门利什曼原虫感染引起宿主细胞miRNA表达谱改变，而一些miRNA调控宿主细胞抗利什曼原虫感染的自噬过程[21-22]。宿主细胞miRNA是否也可以介导细胞抗顶复门原虫感染的自噬过程，需要进一步研究。

2 顶复门原虫miRNA在顶复门原虫感染中的作用机制

研究表明，疟原虫自身基因组中不含miRNA，而且缺乏Dicer和Argonaute核心酶[23]。隐孢子虫全基因组分析无编码Dicer和Argonaute蛋白的序列，也无发现同系物[24]，即隐孢子虫中无产生miRNA所必须的酶，因此隐孢子虫体不表达miRNA，而国内研究报道发现了微小隐孢子虫miRNA[25-26]，因此文献报道微小隐孢子虫表达miRNA值得商榷。弓形虫体内检测到miRNA[27-29]。

研究表明，顶复门原虫miRNA靶向宿主细胞mRNA。病毒miRNA也可以靶向宿主mRNA，如HCMV miR-UL112可能靶向MICB，导致MICB特异性下调最终导致NK细胞的杀伤作用下降。受到病毒的启示，是否弓形虫miRNA也可以靶向宿主mRNA？Saçar等[30]利用生物信息学分析弓形虫miRNA很有可能进入宿主细胞并调节宿主细胞相关基因的表达。因此顶复原虫miRNA直接或间接影响宿主基因的表达还需进一步验证。

3 小结与展望

综上，顶复门原虫感染会引起宿主miRNA改变，而这些改变的miRNA并不完全是由顶复门原虫特异引起的；宿主miRNA的改变可以调控宿主对顶复门原虫的免疫反应、凋亡反应、细胞周期及顶复门原虫基因，而顶复门原虫miRNA也可以调控宿主基因。在miRNA水平上，国外关于顶复门原虫尤其为疟原虫、弓形虫和隐孢子虫与宿主之间相互作用机制的研究并不多，并且主要是关于miRNA对宿主免疫反应的研究，而在miRNA水平上，国内对顶复门原虫-宿主相互作用机制的研究更少，并且主要是顶复门原虫感染对宿主miRNA的影响[2,6,18,25-26,31]和不同基因型/不同生殖阶段顶复门原虫miRNA的改变[32-33]，只是初步研究。

目前关于研究宿主/顶复门原虫非编码RNA的研究存在着一些问题，(1)哪些宿主细胞非编码RNA是由特定寄生虫引起的？(2)同一属不同种原虫甚至同一种不同亚型的原虫导致宿主非编码RNA表达谱是否完全一样？(3)顶复门感染不同宿主细胞引起的宿主/顶复门原虫非编码RNA的变化是否完全不一样？(4)不同感染阶段对宿主/顶复门原虫非编码RNA的影响，不同感染剂量对宿主非编码RNA的影响的研究太少；(5)过多的关注宿主非编码RNA引起的下游反应，而是什么原因造成宿主非编码RNA的改变知之甚少，可能由于顶复门原虫分泌的蛋白造成，也可能宿主细胞通过模式识别受体，如TLR的识别引起宿主非编码RNA的改变；(6)其他非编码RNA，如lncRNA和circRNA，及lncRNA和circRNA与miRNA的相互关系的研究太少；(7)目前大多数研究宿主细胞-顶复门原虫相互作用机制都是通过体外试验，不能真正的表现机体内宿主细胞-顶复门原虫相互作用机制。

相信随着对顶复门原虫及感染宿主细胞miRNA研究的不断深入，我们可以更清楚哪些miRNA是特异的顶复门原虫引起的，为顶复门原虫病提供诊断标记；哪些miRNA有利于顶复门原虫的入侵；哪些miRNA有利于宿主清除顶复门原虫；哪些miRNA是平衡顶复门原虫寄生与宿主细胞抗寄生，为研发抗顶复门原虫药物及疫苗提供新靶标。

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S855.9+9

A

0529-6005(2017)10-0073-04

2017-05-14.

国家自然科学基金面上项目(31672548)和重点项目(30600603)

王臣荣(1985-)，男，硕士生，主要从事人兽共患寄生虫学研究，E-mail: 1203431811@qq.com

张龙现，E-mail：zhanglx8999@henau.edu.cn