烟草的组织培养与植株再生

梁程　李一鹏

摘要：在MS培养基上，接种烟草无菌苗的叶片，分别放在光照和黑暗条件下诱导愈伤组织，接种于MS分化培养基上，在光照下分化再生植株。结果表明：光照和植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导和植株再生产生影响。

关键词：烟草；愈伤组织；植株再生

一、 实验目的

1. 掌握植物组织培养的方法和要点。

2. 学习培养基配制方法、步骤及叶片培养环节中，外植体灭菌、接种、培养观察等技术环节。

3. 了解外植体脱分化及再生过程。

二、 材料与器材

1. 植物材料：烟草叶片。

2. 实验药品：MS培养基、蔗糖、琼脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。

3. 仪器设备：高压灭菌锅、光照培养箱、天平、pH计、超经工作台、酒精灯。

4. 器械及用具：镊子、手术刀、记号笔等。

5. 玻璃器皿：培养瓶、量筒、容量瓶等。

三、 实验步骤

（一） MS培养基母液配制

大量元素配成50倍母液，使用时每1L培养基需要从母液中取20mL。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合。

微量元素配成100倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10mL，配制时应注意充分溶解后再依次混合。

铁盐单独配制，与其他元素混合易造成沉淀。一般采用螯合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，一般扩大100倍。EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75℃～80℃之间让其螯合1h。使用螯合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe2+。有机物质可配成100倍浓缩液，使用时每1L培养基加10mL。（本次实验采用培养基粉末代替较为方便）

（二） 培养基的配制

取1000mL烧杯，先加入500mL的蒸馏水，然后根据培养基成分及用量，吸取各种母液加入烧杯，称取蔗糖（一般用量3%）、琼脂（一般6～8g/L），按需要的浓度加入植物激素，加水至800mL，加热使琼脂融化，定容到1000mL，用1NNaOH或HCl调pH至5.8。

（三） 培养基灭菌

将配好的培养基迅速分装至50mL三角瓶中，用牛皮纸或报纸包扎封口。放入灭菌锅121℃，灭菌20min。

（四） 外植体取材、消毒及接种

自大田或温室取材时应选择无病、无虫、生长健壮的外植体。对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用自来水冲净，在70%酒精中浸30s，再加入消毒剂。不同的材料消毒的方式和所需时间不一样，研究者应根据不同材料确定具体消毒方案。外植体消毒的一般顺序为：外植体——自来水多次冲洗——消毒液处理（75%乙醇30s，消毒液xmin）——无菌水冲洗——无菌滤纸吸干——接种。

（五） 无菌操作

操作前把准备好的培养基、待消毒材料、无菌水、无菌烧杯及其他必需玻璃器皿、无菌操作工具、70%酒精等放到超净工作台上，然后打开超净工作台和紫外灯，让其运行 30min 后再进行操作，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的烧杯中，10min后取出另一盛有无菌水的烧杯中，无菌水冲洗3～4次，然后将材料取出切割后接种在培养基中，封口，放入培养室培养。

四、 结果分析

根据不同时期的观察图片可发现烟草的组织培养与植株再生实验基本上比较成功，烟草的离体组织经过脱分化形成愈伤组织，经过一段时间的再分化形成不定芽等过程。从不同角度、类型的照片可观察到该离体组织的再生能力较强，具有细胞全能性。

五、 心得体会

通过这次组培实验课的机会，我基本上成功地了解开展组培实验需要的基本条件，整个过程使我自身受益匪浅，同时我也学到了很多实用的东西。从最基础的称量药品到比较复杂的制作培养基、植物接种等等，都在渐渐地学习着。虽然由于时间的缘故，我学到只是组培最基本的过程，但我希望在以后可以有机会学到更多关于植物组织培养的操作技术。在培养基的配制过程中我们搅拌要注意不能让琼脂黏在玻璃杯底部变黑，要不停地搅拌。而且必须使之沸腾才能在移液后使培养基凝固以便于下一步的操作。并且，如果没有加入这个课程实验，我可能不会接触到植物的接种。在接种过程中，个人非常紧张，因为一旦外植体被污染，后续实验会相继失败，但是经历了一次接种外植体的过程后，我认为只要我们保持冷静的头脑再加上具备一定基础的组培实验知识就能把这个步骤做好。

在四周的观察期间，第一次我是怀着忐忑的心情去观察的，因为这是我自身的第一次组培成果，当看到我的叶片变黄变白了我赶紧请教老师是不是我的叶片被污染了，在老师细心、详细讲解这个现象后我才知道这个是正常的现象，也逐渐安心下来。接下来几次我都及时记录拍摄烟草离体组织的生长状况。总而言之，我认为组培实验能够良好地培养学生的动手能力和操作能力，不仅如此，在整个实验过程中还收获了不少乐趣，伴随着烟草离体组织的成长历程，我也了解并掌握了组培实验各个过程及相关知识，收获了很多比如每周坚持不懈观察的毅力、细致的观察、精确的实验操作技术。

六、 注意事项

1. 实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败。

2. 配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其他三种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月。

3. pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值。

4. 材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死。

5. 接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7～10d的暗培养，然后再进行光照培养。

6. 无菌操作时应注意下面几个问题：整个操作过程一切用具必须始终保持无菌状态；无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用70%酒精消毒；操作时无菌器皿一旦打开，应尽量避免手再从其上横过；避免强呼吸，呼吸时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。

作者简介：

梁程，李一鹏，浙江省金华市，浙江師范大学。endprint