我国部分苹果产区苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

陈冉冉, 谢吉鹏, 叶 婷, 董云浩, 国立耘, 周 涛

(中国农业大学植物病理学系, 北京 100193)

我国部分苹果产区苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

陈冉冉, 谢吉鹏, 叶 婷, 董云浩, 国立耘*, 周 涛*

(中国农业大学植物病理学系, 北京 100193)

近年来,由苹果锈果类病毒Applescarskinviroid(ASSVd)引起的苹果花脸病、锈果病在我国一些苹果产区日趋严重,对我国苹果生产和苹果产业发展造成严重危害。为了解ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况,采用RT-PCR对陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江6个苹果产区的35份苹果样品进行检测,并克隆获得30个分离物的基因组全序列,大小为330～333个核苷酸。分析表明,这些分离物的基因组全序列与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列相似度为96%～100%,在苹果锈果类病毒属的末端保守区及中央保守区保守,在致病区和左端区域有突变,一些分离物的突变位点相同。系统发育分析表明分离物因相同的突变位点而聚类,而与地理来源无关。

苹果; 苹果锈果类病毒; RT-PCR; 变异分析; 系统发育

苹果是我国重要的栽培果树,其栽培面积和产量居世界首位[1]。由病毒和类病毒引起的苹果病害在我国苹果产区发生普遍,已经成为影响苹果产量和质量的重要因素[2]。苹果锈果类病毒Applescarskinviroid(ASSVd)是马铃薯纺锤块茎类病毒科Pospiviroidae苹果锈果类病毒属Apscarviroid成员[3]。1985年我国学者陈炜等在国内首次报道了ASSVd[4]。1987年Hashimoto等发表了ASSVd的基因组全序列[3]。ASSVd基因组为一条环状的单链RNA,全长约330个核苷酸[3],具有5个功能区,形成稳定的杆状或拟杆状的二级结构[5]。有研究发现类病毒的保守区域与复制密切相关[6-7],RNA的缺失、插入、替换主要发生在致病区和可变区[8]。关于变异位点对ASSVd致病性的影响尚无明确数据,需进一步研究。目前发现ASSVd可侵染苹果[9]、梨[10]、桃[11]、杏[12]和野樱桃[13]等植物。植株一旦感染ASSVd,终生带毒,果树幼树期不出现病症,结果后病症显现,果实的食用价值和商品价值大为降低。

当前我国苹果产业发展迅速,苗木需求量大,因苗木的调运和无性材料的快繁等因素, ASSVd的发生呈加重趋势,在苹果生产中造成的危害日益严重[2]。为研究ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况,本文对采自我国6个苹果产区的35份苹果样品进行检测,克隆得到30个ASSVd分离物的全序列,通过对全序列的比对分析,发现了一些相同的变异位点,为研究ASSVd的变异和进化提供了新的数据。

1 材料和方法

1.1 苹果样品

2011年-2016年在陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江的苹果产区采集有症状的苹果果实样品和无明显症状的枝条样品,共35份(表1)。样品整理后保存于4℃和-20℃。

表1样品基本信息

Table1Informationofsamples

编号Number采集时间/年-月Samplingtime采集地点Samplingsite品种Variety采样部位Tissue样品症状表现Symptomonsamplexa⁃12011-11陕西西安短枝礼富枝条枝条无明显症状(叶片花叶)xa⁃42011-11陕西西安短枝礼富枝条枝条无明显症状(果实花脸)sxqy⁃12015-09陕西千阳未知枝条枝条无明显症状sxqy⁃22015-09陕西千阳未知枝条枝条无明显症状qd⁃12012-07山东青岛SH38枝条枝条无明显症状(果实花脸)qd⁃22012-07山东青岛SH38枝条枝条无明显症状(果实花脸)yt⁃12012-11山东烟台富士果实果实花脸qd⁃32015-09山东青岛未知枝条枝条无明显症状qd⁃42015-09山东青岛未知枝条枝条无明显症状qd⁃52015-09山东青岛未知枝条枝条无明显症状qd⁃62015-09山东青岛未知枝条枝条无明显症状qd⁃72015-09山东青岛未知枝条枝条无明显症状qd⁃82015-09山东青岛未知枝条枝条无明显症状sx⁃12016-04山西瑞阳枝条枝条无明显症状sx⁃52016-04山西瑞阳枝条枝条无明显症状sx⁃82016-04山西瑞阳枝条枝条无明显症状sx⁃142016-04山西瑞阳枝条枝条无明显症状hb⁃32012-11河北未知(砧木)枝条枝条无明显症状hb⁃62012-11河北未知(砧木)枝条枝条无明显症状hb⁃72012-11河北未知(砧木)枝条枝条无明显症状hb⁃82012-11河北未知(砧木)枝条枝条无明显症状hb⁃122012-11河北未知(砧木)枝条枝条无明显症状shz2⁃12012-11北京三合庄富士果实果实花脸cp⁃12012-11北京昌平富士果实果实锈果cp⁃22012-11北京昌平富士果实果实花脸mdj⁃22011-09黑龙江牡丹江金红123果实果实着色不匀mdj⁃112011-09黑龙江牡丹江龙丰果实果实着色不匀mdj⁃122011-09黑龙江牡丹江金红123果实果实花脸mdj⁃132011-09黑龙江牡丹江龙冠果实果实畸形592-022015-11黑龙江牡丹江山丁子枝条枝条无明显症状592-032015-11黑龙江牡丹江山丁子枝条枝条无明显症状592-082015-11黑龙江牡丹江山丁子枝条枝条无明显症状592-102015-11黑龙江牡丹江山丁子枝条枝条无明显症状592-202015-11黑龙江牡丹江山丁子枝条枝条无明显症状592-222015-11黑龙江牡丹江山丁子枝条枝条无明显症状

1.2 方法

1.2.1 植物总RNA的提取

取0.1～0.2 g样品(叶片,枝条韧皮部或果皮)用SiO2吸附法[14]进行植物总RNA提取。提取的RNA直接反转录或-80℃保存备用。

1.2.2 RT-PCR检测

反转录体系为20 μL:2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL、5×M-MLV Buffer 4 μL、M-MLV(40 U/μL)0.5 μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、随机六聚体引物和Oligo(dT)引物各0.5 μL、植物总RNA 3.5 μL,用DEPC水补足至20 μL,42℃水浴反应1 h,产物直接进行PCR或-20℃保存备用。

参照报道的扩增ASSVd全基因组序列的引物(正向引物:5′-CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA-3′;反向引物:5′-CCTTCGTCGACGACG-ACAGGTGAG-3′)[5]进行PCR。PCR反应体系为25 μL:2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.25 μL,正、反向引物各0.5 μL,反转录产物2.0 μL,用ddH2O补足至25 μL。PCR反应循环参数:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,67℃退火30 s,72℃延伸40 s,30个循环;最后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.2.3 PCR产物克隆和测序分析

在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶,使用普通DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收纯化。将纯化的PCR产物连接至克隆载体pMD19-T(simple)上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选单菌落于800 μL含氨苄青霉素(50 μg/mL)的 LB培养基中培养,通过菌液PCR验证鉴定重组质粒,每个样品筛选3个阳性菌液送至北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定。

1.2.4 序列比对和系统进化分析

用DNAMAN软件对所得基因序列进行分析。通过BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比对分析目的片段。序列对比运用DNAMAN软件和Multalin在线软件[15]进行,以GenBank中ASSVd标准序列(NC_001340.1)为对比序列。进化树构建运用ClustalX和MEGA 6.06的邻接法(neighbor-joining)进行,重复次数为1 000,以GenBank中ASBVd(NC_001410)、PSTVd(NC_002030)和ADFVd(NC_003463.1)标准序列作为外组对照,其中ASBVd作为不同科的外组对照,PSTVd作为不同属的外组对照,ADFVd作为同属的外组对照。

2 结果与分析

2.1 ASSVd检测结果

RT-PCR检测结果表明,从采自陕西的4份样品(sxqy-1,sxqy-2,xa-1和xa-4),采自山东的8份样品(qd-1,qd-2,yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7和qd-8),采自河北的5份样品(hb-3,hb-6,hb-7,hb-8和hb-12),采自北京的3份样品(shz2-1,cp-1和cp-2)和采自黑龙江的10份样品(mdj-2,mdj-11,mdj-12,mdj-13,592-02,592-03,592-08,592-10,592-20,592-22)中均检测到330 bp左右的特异片段,与ASSVd阳性对照样品检出的条带一致,表明样品被ASSVd侵染。ASSVd的检测结果如表2所示。

表2RT-PCR检测苹果样品中ASSVd结果

Table2ResultssummaryofdetectionofASSVdinapplesamplesusingRT-PCR

采样地点Collectionsite检测样品数/个NumberofsamplesASSVd阳性样品数/个Numberofpositivesamples阳性检出率/%Detectionrate陕西Shaanxi44100山东Shandong9888．9山西Shanxi400河北Hebei55100北京Beijing33100黑龙江Heilongjiang1010100合计Total353085．7

图1 我国部分苹果产区30个ASSVd分离物基因组核苷酸序列比对Fig.1 Multiple genome sequences alignment of 30 ASSVd isolates from some apple production areas in China

2.2 ASSVd分离物序列测定与变异分析

将30个样品的PCR产物克隆测序,结果表明所有片段的长度均为330～333 nt。序列比对结果表明,扩增得到的30个片段与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列一致性为96%～100%,表明这些片段均为ASSVd基因组序列。其中样品xa-1,xa-4,mdj-2,mdj-11和 mdj-12扩增获得的ASSVd序列与登录号为AF421195.1的核苷酸序列一致性均为100%;样品cp-1,cp-2和shz2-1扩增得到的ASSVd序列与登录号为AY972082.1的核苷酸序列一致性分别为100%,99%和98%;样品qd-1,qd-2,hb-6,hb-7和hb-8扩增获得的ASSVd序列与登录号为HQ326093.1的核苷酸序列一致性均为99%;样品qd-3,qd-7,592-02,592-08,592-10,592-20,qd-8和qd-4扩增得到的ASSVd序列与登录号为KC110860.1的核苷酸序列一致性分别为99%,99%,99%,99%,99%,99%,98%和96%;样品592-03扩增出的ASSVd序列与登录号为HQ840722.1的核苷酸序列一致性为98%;从样品yt-1扩增出的ASSVd序列与登录号为KC110858.1的核苷酸序列一致性为97%;从样品mdj-13,592-22和qd-6扩增出的ASSVd序列与登录号为KU507023.1的核苷酸序列一致性分别为99%,98%和96%;从样品hb-3,hb-12,sxqy-1和sxqy-2扩增出的ASSVd序列与登录号为KP765428.1的核苷酸序列一致性分别为98%,98%,97%和97%。以样品编号命名上述ASSVd分离物。

以GenBank中ASSVd标准序列(NC_001340.1)为对比序列,运用Multalin在线软件比对所有30个分离物的基因组序列,结果如图1所示。所有30条序列及ASSVd标准序列(NC_001340.1)在苹果锈果类病毒属的末端保守区(TCR)及中央保守区(CCR)两个保守区保守,只有qd-6分离物在第12位有T-A突变。变异位点集中在致病区(P区)与左末端区(TLR)交界处。进一步分析不同分离物的序列,发现分离物xa-1,xa-4,sxqy-1,sxqy-2,qd-1,qd-2,hb-3,hb-6,hb-7,hb-8,hb-12,cp-1,cp-2,shz2-1,mdj-2,mdj-11和mdj-12与参考序列一致性较高;分离物yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7,qd-8,mdj-13,509-02,509-03,509-08,509-10,509-20和509-22在第39位存在C-A突变,第251位存在G-A突变,第261位和第262位插入T碱基,第267位存在G-A突变,第290位存在G-T突变,第291位存在A-G突变。

2.3 系统进化分析

进化树分析结果如图2所示。

图2 我国部分苹果产区ASSVd分离物系统进化树Fig.2 Phylogenetic analysis of genomic sequences of ASSVd isolates from some apple production areas in China

30个分离物按突变位点的不同聚为2组,聚集与地理来源无关。与ASSVd参考序列一致性高的分离物xa-1,xa-4,sxqy-1,sxqy-2,qd-1,qd-2,hb-3,hb-6,hb-7,hb-8,hb-12,cp-1,cp-2,shz2-1,mdj-2,mdj-11和mdj-12聚为一组;分离物yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7,qd-8,mdj-13,509-02,509-03,509-08,509-10,509-20和509-22聚为一组。这些组与外组对照分区明显。

3 讨论

近年来,ASSVd在我国苹果产区的发生率逐年增加,若不及时、正确地防控,将对我国苹果产业造成严重危害。本研究采集我国6个苹果产区的疑似被ASSVd侵染的苹果果实样品和一些无症状的枝条样品35份,利用RT-PCR方法进行ASSVd检测,结果表明,采自陕西、山东、河北、北京及黑龙江的苹果样品检测到ASSVd,样品的阳性检出率为88.9%～100%。这些数据表明我国一些苹果产区有ASSVd发生。将来的工作将在更广地区采集更多样品进一步调查我国苹果产区的ASSVd发生情况。

本研究成功克隆了30个ASSVd分离物的基因组全序列,序列比对结果表明这些序列含有相同的保守区域(CCR和TCR)。变异位点集中在致病区域和可变区域,这与之前的研究发现类病毒RNA的缺失、插入、替换主要发生在致病区和可变区的结果一致[8]。关于变异位点对ASSVd致病性的影响尚无明确数据,需进一步研究。进化树分析表明所有30条ASSVd序列聚集成两组,并且分离物因相同的变异位点而分组聚类。变异位点分析表明来自同一品种的分离物亦无特异性变异,同一地理来源的分离物无特异性变异,其中黑龙江的‘山丁子’样品和山东部分样品存在相同的变异位点,推测这可能与苗木的调运和接穗的随意嫁接有关。

鉴于ASSVd的发生对我国苹果生产造成严重危害,并有逐年加重的趋势,应及时采取防控措施,切断ASSVd传播源头,尽早更换病树。ASSVd的传播途径主要有种子[16]、带毒枝条嫁接以及修剪工具导致的污染传播[17]。因为目前无有效的防治药剂,因此防控ASSVd的根本措施应以预防为主,选用无毒苗木。

[1] 杨振锋,丛佩华,聂继云,等.我国苹果产业现状、存在问题及建议[J].北方果树,2006(5):34-36.

[2] 郝璐,叶婷,陈善义,等.我国北方部分苹果主产区病毒病的发生与检测[J].植物保护,2015,41(2):158-161.

[3] Hashimoto J,Koganezawa H.Nucleotide sequence and secondary structure ofApplescarskinviroid[J]. Nucleic Acids Research,1987,15(17):7045-7052.

[4] 陈炜,田波.苹果锈果病组织中发现的类病毒RNA [J].科学通报,1985,30(17):1360.

[5] Hadidi A,Huang C,Hammond R W,et al.Homology of the agent associated with dapple apple disease to apple scar skin viroid and molecular detection of these viroids [J].Phytopathology, 1990, 80(3):263-268.

[6] Baumstark T,Schroder A R,Riesner D.Viroid processing: switch from cleavage to ligation is driven by a change from a tetraloop to a 1oop E conformation[J].The EMBO Journal,1997,16(3):599-610.

[7] Gas M E,Hernndez C,Flores R,et al.Processing of nuclear viroidsinvivo:an interplay between RNA conformations [J].PLoS Pathogens,2007,3(11):1813-1826.

[8] Kyriakopoulou P E,Osaki H,Zhu Shuifang,et al.Applescarskinviroidin pear [M]∥ Hadidi A,Flores R,Randles J W.Viroids.Australia:CSIRO Publishing,2003:142-145.

[9] Puchta H,Luckinger R,Yang X C,et al.Nucleotide sequence and secondary structure ofApplescarskinviroid(ASSVd) from China [J].Plant Molecular Biology,1990,14(6):1065-1067.

[10] Kyriakopoulou P E,Hadidi A.Natural infection of wild and cultivated pears withApplescarskinviroidin Greece [J].Acta Horticulturae,1998(472):617-625.

[11] 赵英,牛建新.新疆桃树上苹果锈果类病毒(ASSVd)的检测与全序列分析[J].果树学报,2008,25(2):274-276.

[12] Zhao Ying, Niu Jianxin. Apricot is a new host ofApplescarskinviroid[J].Australasian Plant Disease Notes,2008,3(1):98-100.

[13] Walia Y,Dhir S,Bhadoria S,et al.Molecular characterization ofApplescarskinviroidfrom Himalayan wild cherry [J].Forest Pathology,2012,42:84-87.

[14] 董雅凤,张尊平,杨俊玲,等.葡萄卷叶病毒3 RT-PCR检测技术研究[J].中国果树,2005(6):9-12.

[15] Walia Y,Kumar Y,Rana T,et al.Molecular characterization and variability analysis ofApplescarskinviroidin India [J].Journal of General Plant Pathology,2009,75:307-311.

[16] 梁成林,赵玲玲,宋来庆,等.几种苹果实生砧木种子传毒潜力检测[J].果树学报,2014,31(6):1164-1169.

[17] 白海霞,高彦,贾少武,等.选用苹果无毒苗木防控病毒病危害[J].西北园艺(果树),2015(3):13-15.

(责任编辑： 杨明丽)

DetectionandfullnucleotidesequencesanalysisofApplescarskinviroidisolatesinsomeappleproducingareasofChina

Chen Ranran, Xie Jipeng, Ye Ting, Dong Yunhao, Guo Liyun, Zhou Tao

(DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

In recent years, dappling, scarring and malformation on apple fruits caused byApplescarskinviroid(ASSVd) is increasing and seriously affects apple production and apple industry development in China. To understand the occurrence and variations of ASSVd in apple production regions of China, 35 samples were collected from six major apple producing areas including Shaanxi, Shandong, Shanxi, Hebei, Beijing and Heilongjiang provinces. Reverse transcription-PCR and sequence analysis showed that 30 isolates of ASSVd were obtained with genome sizes of 330-333 nucleotides, which had 96%-100% identities with sequences of ASSVd in GenBank, and had conserved terminal conserved region (TCR) and central conserved region (CCR). Mutations were found in pathogenic region and terminal left region. Interestingly, same mutation sites were found in some isolates. Phylogenetic analysis showed that these isolates clustered due to mutation sites on ASSVd genome while no relation to geographical origins.

apple;Applescarskinviroid; RT-PCR; variation analysis; phylogenesis

2016-11-22

2017-01-20

国家现代农业(苹果)产业技术体系(nycytx-08-04-02); 国家公益性行业(农业)科研专项(201203076-02)

* 通信作者 E-mail: ppguo@cau.edu.cn;taozhoucau@cau.edu.cn

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.015