头穴透刺对JNK通路抑制后脑出血大鼠脑组织p-STAT3影响的研究*

孔 莹 段洪超 刘 洋 王 策 谭元奇

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150040；3.北京市石景山区中医院，北京 100043）

头穴透刺对JNK通路抑制后脑出血大鼠脑组织p-STAT3影响的研究*

孔 莹1段洪超2刘 洋1王 策1谭元奇3△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150040；3.北京市石景山区中医院，北京 100043）

目的针刺急性期脑出血模型大鼠百会透曲鬓穴，观察JNK通路被抑制后其下游通路蛋白p-STAT3的表达变化及头针对脑组织是否起到保护作用。方法选用雄性SD大鼠84只随机分为空白组与假手术组各6只，模型组、针刺组（模型+针刺组）与SP600125（模型+抑制剂组）各24只；造自体血脑出血模型，选择针刺百会穴透曲鬓穴的方法，在头部一针贯穿顶额颞三区。于造模成功后针刺，在6 h，1 d，3 d，7 d 4个时间点取材，采用免疫组化分析法（IHC）观察脑组织内p-STAT3的阳性细胞灰度值。结果针刺百会透曲鬓穴可以减轻模型动物神经缺损症状，提高评分。p-STAT3在大鼠脑出血后6 h表达开始增多，1 d表达相对最多，3 d达高峰后迅速减少，7 d仍有表达。针刺组各时间点阳性细胞灰度值均比模型组降低，具有显著差异。针刺组与SP600125组比较差异有统计学意义。结论针刺百会透曲鬓穴能够减轻大鼠神经功能缺损程度评分，并降低p-STAT3蛋白的表达，表明针刺在脑出血的治疗中起到了脑保护作用。

脑出血 百会透曲鬓 p-STAT3

脑出血（ICH）是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，ICH和蛛网膜下腔出血（SAH）占所有卒中的20%。脑出血的发病率有种族差异：黑种人、西班牙人和亚洲人的发病率较高，白种人发病率较低，西方以缺血性脑卒中为主，而中国人更易发生出血性脑卒中，中国人出血性脑卒中与缺血性脑卒中的发病率相当［1］。JAK/STAT细胞内信号转导途径是由JAKS蛋白家族和STATS蛋白家族组成，JAKs活化后可以募集细胞浆内相应的信号传导和底物STATS，从而使STATS活化，转变为磷酸化的STATS，即p-STAT。p-STAT以二聚体（同源或异源）的存在方式移向核内，作用于目的基因的启动子，直接激活目的基因表达［2］。许多研究发现JAK/STAT信号转导途径可以诱导细胞的增殖、分化或凋亡过程，而STAT3与神经细胞密切相关。本课题观察JNK通路被抑制剂后，针刺百会透曲鬓穴疗法对不同组大鼠p-STAT3表达的影响，探讨本针刺方法对脑出血急性期后继发性损伤的神经保护机理及与大鼠脑组织中p-STAT3免疫组化表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性SD大鼠，8周龄，体质量 （300±20）g，购于哈尔滨兽医研究所，动物许可证号：SCXK（吉）-2013-0002。饲养1周后开始造模，造模前给予光照周期12 h，黑暗 12 h，禁食12 h，禁水6 h。

1.2 试药与仪器

立体定位仪，成都市仪器厂，ST-5ND-C；台式牙钻机，上海市齿科医械厂，307-6型；组织包埋机，天津市久圣医疗电子仪器有限公司，JBM-A；自动脱水机，天津市航空机电公司，TSJ-1型；石蜡展片机，天津航空机电公司，ZPJ-1型；50 μL微量注射器，上海市高鸽仪器厂；1.5 寸针灸针，安迪牌；SP600125，碧云天生物；DMSO，Sigma美国中国分装；p-STAT3免疫组化试剂盒，碧云天生物；多聚甲醛，天津博迪化工分析纯；羊抗兔IgG，武汉博士德；PV-6001二步免疫组化检测试剂，北京中衫金桥生物；PV-6002二步免疫组化检测试剂，北京中衫金桥生物；DAB显色试剂盒，北京中衫金桥生物。

1.3 模型制备

首先腹腔麻醉大鼠，使其固定于立体定位仪上，头部矢状位切皮，根据大鼠脑立体定位图谱［3］确定右侧尾壳核位置，参照邹氏法和Rosenberg BG方法［4］制作脑出血大鼠模型。暴露前囟及冠状缝，确定了前囟Bregma 点，用牙科钻头在其右侧旁开 3.5 mm，后 0.2 mm钻直径约为1.0 mm的圆孔至硬脑膜后停止。用微量注射器取自体血（断尾）50 μL注射，注射后留针约5 min。造模过程中的数量大于84只，如有死亡，每个时间点均可以补充。待麻药代谢后大鼠转为清醒状态，采取Berderson［5］评分法选择符合标准的模型。

1.4 分组与干预

将健康雄性SD大鼠随机选取12只：空白组6只大鼠，假手术组6只大鼠。其余造模，分为模型组、针刺组、SP600125组，此3组每组24只。空白组不作任何处理。假手术组：颅骨钻孔，术后缝合，不注入自体血。模型组随机选取24只大鼠，按时相分为6 h，1 d，3 d，7 d 4个时间点，每个时间点6只大鼠，于造模成功后相应时间点取材。针刺组随机选取24只大鼠，按时相分为 6 h，1 d，3 d，7 d 4个时间点，每个时间点 6 只大鼠，于脑出血造模后6 h，1 d，3 d，7 d分别给予针刺治疗。根据华兴邦的大鼠穴位图谱针刺患侧百会透曲鬓穴。参照针灸技术操作规范［6］（头针部分）操作：大鼠针刺部位用75%的酒精消毒，由中心区向外擦拭，将1.5寸针灸针迅速刺入帽状腱膜下层，针体与皮肤呈30°角进针，每次进针0.8寸，操作者肩肘腕关节和拇指固定不动，保持毫针固定，食指第一、二节呈半屈曲状，用拇指食指持住针柄，食指掌指关节做屈伸运动，以200r/min速度捻转。各时间点给予针刺1次，留针30min，期间捻转3次，每次3 min（同一人操作）。SP600125组随机选取24只大鼠，按时相分为 6 h，1 d，3 d，7 d 4个时间点，每个时间点6只大鼠。配置的DMSO质量浓度为10mL/L，SP600125质量浓度为3g/L。使SP600125溶于DMSO溶液，取10 μL，于脑出血造模前10 min给药，注入侧脑室，造模同模型组。

1.5 标本采集与检测

造模成功后在相应时相点，腹腔注射水合氯醛进行麻醉，麻醉后快速用多聚甲醛灌注，待大鼠双肺呈白色，躯体如板状后，断头取脑。以注射自体血针道为中心做厚度约5mm冠状切片。部分标本将其放入4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS固定液中固定用于HE染色，按常规步骤进行脱水、浸蜡、包埋，最后制成厚度大约为5 μm的石蜡切片。

1.5.1 HE染色 石蜡切片，脱蜡水化，苏木精 5 min，然后水洗。经过20 s的盐酸酒精分化后水洗，水洗要求充分。用弱氨水返蓝，再次持续20 s。然后用水浸泡10 min后，给予伊红染色，用酒精和二甲苯分别脱水，透明，中性树胶封片。

1.5.2 p-STAT3的 IHC测定 首先切片常规脱蜡至水，置于3%双氧水中充分在室温下浸泡孵育后，热抗原修复至自然冷却与室温一致，滴加一抗（适当稀释的p-STAT3多克隆抗体 1∶200），4℃孵育过夜，用0.01 mol/L PBS冲洗。然后滴加生物素化二抗工作液30 min，再次用 0.01 mol/L PBS 冲洗，清洗后 DAB 显色5～30 min，镜下控制显色时间，并用蒸馏水充分冲洗，苏木素复染并用中性树胶封片。

1.5.3 图像分析 显微镜下，DAB显色阳性细胞呈棕黄色或褐色，利用Motic image 3.2图像采集系统采集图像并进行分析在Motic-BA 400倍显微镜视野下观察。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 排除大鼠应激反应造成的神经功能缺损

大鼠造模苏醒后，不排除会出现应激反应，所以本实验经过评分后筛选造模成功（成模标准：提尾倒挂大鼠患侧前肢紧贴胸壁或活动时向对侧倾倒，甚至不能行走）大鼠。如果是应激反应造成神经功能的缺损，随着时间的延长（3 d内），大鼠症状会减轻，而本实验造模成功的大鼠，神经缺损症状会加重，评分增高。

2.2 各组大鼠不同时间点和不同干预方法下的神经功评分情况

见表1。大鼠平均在术后30 min苏醒，空白组大鼠和假手术组无神经功能缺损，大鼠活动能力与之前无明显差异。而造模成功后大鼠出现了不同程度的神经功能缺损症状。脑出血病灶对侧肢体出现了爬行时划圈和与人类相似的前肢屈曲回收于腹下，后肢外展的症状。造模后的大鼠6 h即有上述症状，3 d时受损情况最为明显，随后逐渐减轻。针刺组与SP600125组大鼠的临床表现优于模型组大鼠，针刺组与模型组比较，6 h，1 d 评分差异有统计学意义（P＜0.05），3 d，7 d评分有显著差异 （P＜0.01）。SP600125组与模型组比较有明显差异（P＜0.01），而针刺组与SP 600125组比较，在各时间点均有显著差异（P＜0.01）。

表1 各组大鼠神经功能缺损体征评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能缺损体征评分比较（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与SP600125组比较，△P＜0.01。下同。

6 h 1 d 3 d 7 d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.17±0.72 2.25±0.44 2.83±0.83 1.75±0.44针刺组 24 1.53±0.48*△ 1.75±0.45*△ 2.15±0.44**△ 1.08±0.50**△SP600125 组 24 1.12±0.75**1.38±0.60**1.50±0.62**0.63±0.60**组 别 n空白组 6假手术组 6模型组 24

2.3 各组大鼠不同时间点p-STAT3的表达

见表2。空白组和假手术组大鼠脑组织神经细胞结构及形态正常，未见p-STAT3阳性细胞表达，故未计入统计范围内。p-STAT3主要表达于细胞核和胞质中，胞质内表达量较少。表达在大鼠脑出血1 d后增多，3 d达高峰后迅速减少，7 d仍有表达。p-STAT3在大鼠脑出血后6 h表达开始增多，1 d表达相对最多，3 d达高峰后迅速减少，7 d仍有表达。针刺组各时间点阳性细胞灰度值均比模型组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。针刺组与SP600125组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠不同时间点p-STAT3灰度值比较（±s）

表2 各组大鼠不同时间点p-STAT3灰度值比较（±s）

6 h 1 d 3 d 7 d 2.67±0.82 2.67±0.82 2.67±0.82 2.67±0.82 3.17±0.75 3.17±0.75 3.17±0.75 3.17±0.75 8.25±0.93 45.56±5.41 32.63±4.02 17.50±1.51针刺组 24 7.33±1.75*△ 39.17±4.23*△ 28.00±1.79*△ 14.18±1.47*△SP600125 组 24 5.45±0.84**31.67±4.75**24.92±3.88**10.50±2.88**组 别 n空白组 6假手术组 6模型组 24

2.4 各组大鼠脑组织形态学观察

光镜下可见，空白组和假手术组标本神经元细胞和胶质细胞饱满，未见炎性浸润，血管内皮结构正常，胞内核仁清晰，核染色质分布均匀，组脑组织结构完整。术后6 h，组织内血肿带出现，且边界混乱不清晰，部分神经细胞表现出核固缩，炎性细胞开始表现出浸润，胶质细胞发生了肿胀改变，组织细胞间隙可见条索状等不规则空泡，脑组织液化，开始出现坏死。1 d逐渐加重，3 d表现比其他时间点明显，7 d后，血肿组织缩小，胶质细胞在增生后回缩，细胞层次混乱不清。针刺组和SP600125组较模型组损害减轻。

3 讨 论

JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶家族的成员之一，JNK信号通路可被细胞因子、生长因子、应激等多种因素激活，在细胞增殖与分化、细胞凋亡、应激反应等多种细胞调控方面起着至关重要的作用［7］。其主要作用是参与了细胞的凋亡过程。SP600125通过可逆性竞争ATP抑制JNK磷酸化，选择性抑制JNK-1、2、3，从而起到抑制JNK信号转导通路的作用［8］。同时，SP600125参与了抑制细胞活化和分化，并且影响炎症基因的表达，Bennett等通过实验证实SP600125具有抑制细胞凋亡的发生和对细胞免疫调节起到良性作用［9］。STAT3作为JNK下游的JAK/STAT3信号转导通路蛋白，参与了细胞的增殖，分化，凋亡等多个生理病理过程［10］，有研究显示大鼠在脑出血和脑缺血时，JAK/STAT3信号通路可立即被引发激活，而抑制本条通路的激活可以通过减少神经元死亡而起到脑保护作用［11-12］。本实验选取百会透曲鬓穴进行针刺，此两穴是治疗中风效果较为理想的经验效穴，现代研究证明［13-17］可以减轻水肿程度、影响自噬相关蛋白，抑制或减轻炎性反应，抑制细胞凋亡，从而保护了受损的神经，起到对脑的良性调节作用。古代医学认为百会位于头巅顶部，属督脉，是手足三阳、足厥阴、督脉诸经之会，功能祛风、醒脑、宣闭、开窍、泄热，且是为诸阳之会，百脉之宗。其穴位解剖位置在浅表皮肤层布有枕动、静脉吻合网及额神经和枕大神经，脑内深层布有大脑皮质运动区、旁中央小叶和动静脉网，针刺百会穴通过神经体液调节可以达到改善神经缺损症状［18-19］。曲鬓位于足少阳经，是足太阳和足少阳之会，其解剖位置在颞肌中，有颞浅动、静脉，耳颞神经颞支分布。此种针刺方法跨过了顶、额、颞3区，同时督脉、足太阳、足少阳3经贯穿，这一穴区经脉从头至足纵贯全身，起到统调一身之阳气、醒脑开窍的功能。在百会至曲鬓穴区进行透刺，其现代解剖位置同样与本病相符合，再施以快速捻转手法，可以鼓动头部经气的运行，通达全身经络系统。

从本实验观察到脑出血造模成功后，p-STAT3的表达即开始升高，针刺组p-STAT3的表达同样升高，但是低于模型组，且与抑制剂的作用方向一致，表明本针刺方法抑制了p-STAT3的表达，起到了脑保护作用，为临床中医治疗脑出血提供了实验基础。

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Study of Penetration Acupuncture on p-STAT3 of Cerebral Hemorrhage Rats′Brain Tissues after JNK Pathway Inhibition

KONG Ying，DUAN Hongchao，LIU Yang，et al. Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China.

Objective：To observe the expression variation of JNK pathway′s downstream of molecule-p-STAT3，after JNK pathway inhibition by acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7） on acute cerebral hemorrhage model rats，and to observe whether acupuncture had protection on brain tissues.Methods：84 male SD rats were randomly divided into 5 groups： blank groups，sham operation group，the model group，acupuncture group（model and acupuncture group） and inhibitor group（SP600125）.Each group had 24 rats.The mode rats of autologous blood cerebral hemorrhage were made，and after modeling success，they were acupunctured through the three parts of frontal，parietal and temporal with one needle by the method of acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7）.After successful modeling，acupuncture was taken at four points： 6 h，3 d and 7 d，and the gray value of p-STAT3 positive cells in brain tissue was observed by immunohistochemistry （IHC）.Results：Acupuncture penetrating Baihui（GV20）and Qubin （GB7）could reduce the nerve defect symptoms and improve the score of model animals.The expression of p-STAT3 began to increase in the six hours after intracerebral hemorrhage in rats，and the expression was the most in the first day，and decreased rapidly after reaching the peak on the third day，and still expressed on the seventh day.The gray value of the positive cells in the acupuncture group was lower than that in the model group at each time point，and the difference was significant.There was statistical significance between acupuncture group and SP600125 group.Conclusion：Acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7） can reduce the degree of neurologic impairment and reduce the expression of p-STAT3 protein in rats，which indicates that acupuncture plays a neuroprotective role in the treatment of intracerebral hemorrhage.

Cerebral hemorrhage；Acupuncture penetrating Baihui（GV20） and Qubin（GB7）；p-STAT3

R245.3

A

1004-745X（2017）11-1895-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.005

黑龙江中医药大学博士创新基金 （2017bs05）；黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12531633）；黑龙江省博士后资助项目（LBH-Z12249）；黑龙江省中医药大学附属第二医院科研基金资助面上项目（YM-201701）

△通信作者（电子邮箱：damwaongi123@aliyun.com）

2017-07-24）