米根霉利用玉米芯渣同步糖化发酵联产富马酸和真菌壳聚糖

李鑫，顾夕梅

(江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，南京林业大学化学工程学院，南京 210037)

米根霉利用玉米芯渣同步糖化发酵联产富马酸和真菌壳聚糖

李鑫，顾夕梅

(江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，南京林业大学化学工程学院，南京 210037)

以碱处理玉米芯渣为原料，研究米根霉利用高质量浓度玉米芯渣同步糖化发酵(SSF)生产富马酸，同时从米根霉菌体中提取真菌壳聚糖。结果表明，高底物质量浓度纤维素酶水解提高了葡萄糖质量浓度，有利于米根霉发酵产富马酸。米根霉利用质量浓度为100 g/L的玉米芯渣SSF，发酵至72 h，富马酸质量浓度达到28.65 g/L，是质量浓度为50 g/L玉米芯渣SSF中富马酸质量浓度的1.95倍。采用碱法从米根霉菌体中提取壳聚糖，米根霉壳聚糖脱乙酰度为90%；米根霉壳聚糖溶液(质量浓度为20 g/L)黏度为2 mPa·s，米根霉壳聚糖的重均分子量和数均分子量分别2 578 和1 532 u。本研究实现了米根霉以木质纤维原料为碳源联产富马酸和真菌壳聚糖，为木质纤维原料高值生物转化有机酸和生物高分子提供成本较低的新途径。

米根霉；同步糖化发酵；木质纤维原料；联产；富马酸；壳聚糖

作为地球上最丰富的可再生生物质资源之一，木质纤维原料具有价廉、易得、量大、可再生等特点，适合替代化石资源，用以生产能源及化学品[1-2]。我国农业废弃物资源潜力巨大，其中，农作物秸秆资源量达到4.33亿～6.35亿t[3-4]。除秸秆还田、饲料、造纸、食用菌基料等用途，废弃秸秆的主要处理方式为直接燃烧[3]，易造成环境污染。因此，农业废弃物资源化利用受到科研人员的广泛关注。

富马酸作为重要的四碳有机羧酸广泛应用于食品、医药、化工等领域，被美国能源部认定为12种最具开发潜力的平台化合物之一[5-6]。根霉属微生物为生产富马酸的最佳生产菌株[7]。同时，葡萄糖转化为富马酸的理论转化率达到129%。与木质纤维原料转化燃料乙醇相比较，木质纤维原料转化富马酸具有更高的原料利用度[7]。

壳聚糖为自然界中存在的碱性同多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和生物安全性，在药学和材料学领域备受关注[8]。与虾、蟹来源的壳聚糖相比，微生物来源的壳聚糖具有生产不受季节影响、安全性高、生产低污染等优势[9]。米根霉菌体中富含壳聚糖，占菌体干质量13%以上，所提取的真菌壳聚糖是生产高品质生物材料的较理想原料[9]。这说明除富马酸，真菌壳聚糖也是米根霉生产的有价值产品之一[10]。因此，米根霉适合生产真菌壳聚糖[11]。

笔者以米根霉为生产菌种，利用碱处理的玉米芯渣为碳源，研究高底物质量浓度同步糖化发酵(SSF)生产富马酸，并联产真菌壳聚糖。发酵后，废弃的米根霉菌体用以提取真菌壳聚糖，并对其性能进行表征。通过研究米根霉利用木质纤维原料联产富马酸和真菌壳聚糖，为木质纤维原料高值生物转化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

米根霉(Rhizopusoryzae) CICC 40351，购于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。

1.1.2 原 料

玉米芯渣，由江苏康维生物有限公司提供，为碱处理玉米芯渣；商品壳聚糖和葡聚糖标准品，均购于Sigma公司。

1.1.3 纤维素酶

纤维素酶Ctec2，酶活257.57 U/g，购于诺维信公司。

1.1.4 培养基

斜面培养基(g/L):酵母膏3.0；麦芽浸膏3.0；琼脂20.0；蛋白胨5.0；葡萄糖10.0。

基础培养基(g/L):葡萄糖40.0；硫酸铵 4.4；KH2PO40.6；MgSO4·7H2O 0.5；ZnSO4·7H2O 0.017 6；FeSO4·7H2O 0.000 498；pH 2.3～2.7。

发酵培养基(g/L):玉米芯渣50～150；硫酸铵0.71；KH2PO40.6；MgSO4·7H2O 0.5；ZnSO4·7H2O 0.01；FeSO4·7H2O 0.000 4；碳酸钙 30(需要单独灭菌)；纤维素酶用量为25 U/g；加入0.05 mol/L缓冲液维持发酵液pH为4.8左右。

以上培养基均在0.1 MPa、121℃条件下灭菌15 min。

1.2 方 法

1.2.1 纤维素酶水解

称取一定量绝干玉米芯渣于酶解瓶中，加入柠檬酸缓冲液(pH 4.8)，使玉米芯渣质量浓度为50～150 g/L，分别加入25 U/g纤维素酶。在50℃、150 r/min的条件下酶水解72 h。酶水解后，酶解液以10 000 r/min速度离心10 min，取上清液测定其中的葡萄糖质量浓度。

1.2.2 孢子悬浊液

将储存于冰箱中的米根霉菌种取少量米根霉孢子，接种于斜面培养基上，在30℃条件下培养6～7 d。使用5 mL无菌水冲洗长满孢子的米根霉菌丝3次，用纱布过滤，得到米根霉孢子悬浊液，再将孢子浓度稀释至107个/mL。

1.2.3 基础培养

向三角瓶(250 mL)中加入50 mL基础培养基，接入5 mL孢子悬浊液，在35℃、200 r/min条件下摇床培养24 h。

1.2.4 发酵培养

在250 mL的三角锥形瓶中，加入50 mL发酵培养基，接入5 mL基础培养液，置于38℃、220 r/min的摇床培养60 h。

1.2.5 真菌壳聚糖提取方法

发酵后，米根霉菌体用G3砂芯漏斗过滤后，纯水洗涤菌体3次，于60℃烘干至质量恒定。使用1 mol/L NaOH溶液按照固液比1∶40(g/mL)于121℃条件下处理15 min，水洗沉淀至中性；然后用质量浓度为20 g/L的乙酸溶液于95℃水浴中保温24 h，离心分离，取上清液，加入质量浓度为500 g/L的NaOH溶液至偏碱性，沉淀壳聚糖；固液分离后，水洗沉淀至中性，真空冷冻干燥得壳聚糖粉末。

1.2.6 分析方法

发酵样品的制备：发酵结束后，使用NaOH溶液，调节发酵液pH至偏碱性，再用硫酸溶液将pH调至7左右，将富马酸转化为易溶于水的钠盐形式进行分析检测。离心后，取上层清液待测。

采用血球计数板法计数孢子的数量；采用NREL方法测定玉米芯渣三素(纤维素、半纤维素和木质素)质量分数[12]；采用滤纸酶活的标准方法测定纤维素酶活力[13]。按照文献[9]方法测定壳聚糖脱乙酰度和黏度。

采用高效液相色谱法测定葡萄糖、富马酸、乙醇质量浓度，设备为Agilent 1200高效液相色谱仪(德国，1200)，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87糖柱，以5 mmol/L硫酸为流动相，流速0.6 mL/min，柱温55℃，示差折光检测器，进样量10 μL。

分子量的测定：称取一定质量的壳聚糖粉末，溶解于质量浓度为20 g/L的乙酸溶液，配制成1 g/L的样品，在10 000 r/min条件下离心5 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤后，用于测定分子量。使用1260安捷伦高效液相色谱仪(德国，1260 Infinity)，色谱柱采用Waters Ultrahydrogel TM 2000(7.8 mm×300 mm)、Waters Ultrahydrogel TM 250(7.8 mm×300 mm)和Waters Ultrahydrogel TM 120(7.8 mm×300 mm)三柱串联。保护柱为Waters Ultrahydrogel TM Guard Column(6 mm×40 mm)，示差检测器，以超纯水为流动相，流速为0.60 mL/min，柱温为65℃。

2 结果与分析

2.1 原料及纤维素酶水解

对未处理玉米芯和碱处理的玉米芯渣进行三素分析，物料中纤维素、半纤维素、木质素的含量如表1所示。由表1可知，玉米芯中含纤维素360.1 g/kg、半纤维素368.4 g/kg，碳水化合物总量达728.5 g/kg。玉米芯经碱处理后，半纤维素和木质素含量明显下降，纤维素含量提高至669.5 g/kg。玉米芯中半纤维素和木质素的溶出解除了半纤维素和木质素对纤维素的保护，从而增加纤维素比表面积，有利于提高酶水解得率[14]。

表1 原料成分Table 1 Composition of materials /(g/kg-1)

以玉米芯渣为底物，纤维素酶用量为25 U/g，研究玉米芯渣质量浓度对纤维素酶水解玉米芯渣的影响，结果如图1所示。由图1可知，随底物质量浓度的增加，葡萄糖质量浓度也随之增加，但葡萄糖得率呈现下降趋势。质量浓度为150 g/L的玉米芯渣酶解72 h后，葡萄糖质量浓度达到106.65 g/L，与50 g/L玉米芯渣相比，葡萄糖质量浓度升高了2.74倍，但葡萄糖得率由50 g/L玉米芯渣的96.88%下降到150 g/L玉米芯渣的87.95%。因此，增加玉米芯渣质量浓度虽然提高了葡萄糖的质量浓度，但降低了葡萄糖的得率。这是由于纤维素酶的可及性下降以及传质受限，影响了高底物质量浓度的纤维素酶水解[15]。高底物质量浓度酶水解提高了葡萄糖质量浓度，为后续的米根霉发酵提供充足的碳源，进而获得较高的富马酸质量浓度。

图1 不同质量浓度玉米芯渣72 h纤维素酶水解Fig. 1 The 72 h enzymatic hydrolysis of corncob residueat different substrate loadings

2.2 不同质量浓度玉米芯渣对米根霉同步糖化发酵产富马酸的影响

以不同质量浓度的玉米芯渣(50，100和150 g/L)为碳源米根霉SSF产富马酸的结果如表2所示。由于高底物质量浓度限制纤维素酶水解，因此100和150 g/L玉米芯渣SSF过程中设置24 h预酶解。由表2可知，玉米芯渣质量浓度的增加对米根霉SSF产富马酸影响较大。玉米芯渣质量浓度为100 g/L时，富马酸质量浓度最高，为20.22 g/L；进一步增加底物质量浓度，富马酸质量浓度下降，体系中残留较多葡萄糖，说明玉米芯渣质量浓度高于100 g/L不利于米根霉SSF产富马酸。米根霉为好氧发酵菌株，高玉米芯渣质量浓度降低了同步糖化发酵效率，限制氧气的传质，增加体系的黏度，不利于微生物同步糖化发酵产有机酸[15]。因此，选择100 g/L玉米芯渣质量浓度开展后续SSF研究。

表2 玉米芯渣质量浓度对同步糖化发酵的影响Table 2 Effects of different solid loadings on simultaneous saccharification and fermentation

2.3 以玉米芯渣为碳源米根霉同步糖化发酵产富马酸

米根霉分别以50和100 g/L的玉米芯渣SSF产富马酸，结果如图2所示。由图2a可见，50 g/L玉米芯渣SSF发酵12 h后进入快速产酸期，48 h时富马酸质量浓度达到最高值，说明低玉米芯渣质量浓度有利于SSF较快生产富马酸。由图2b可见，发酵18 h时，发酵液中没有富马酸积累，随后发酵液中开始积累富马酸；但葡萄糖质量浓度表现为直线下降趋势。米根霉为非生长耦联型的产有机酸机制，米根霉菌体生长结束后开始分泌富马酸[16]。SSF至72 h时，富马酸的质量浓度达到最高值28.65 g/L，是50 g/L玉米芯渣SSF(图2a)中富马酸质量浓度的1.95倍。在100 g/L玉米芯渣SSF中，玉米芯渣转化富马酸的得率为14.33%，与50 g/L玉米芯渣SSF的14.72%接近。高玉米芯渣质量浓度SSF由于体系的高黏度及限制传质，延迟了米根霉生产富马酸。同时，在高玉米芯渣质量浓度SSF过程中，主要副产物乙醇的质量浓度呈现先升高后降低的趋势，在48 h时达到最高值6.7 g/L，随后缓慢降低；在50 g/L玉米芯渣SSF中，副产物乙醇质量浓度表现为先积累后稳定的趋势，发酵结束时乙醇质量浓度为3.93 g/L。乙醇质量浓度的差异进一步说明高玉米芯渣质量浓度SSF体系内形成复杂的气-液-固多相体系，限制体系内的传质[17]，特别是氧气的传质，使之呈现“假厌氧环境”，导致乙醇质量浓度的增加，但随后体系内玉米芯渣质量浓度的降低缓解了氧传质问题，表现为乙醇质量浓度下降。

图2 玉米芯渣同步糖化发酵产富马酸、乙醇和葡萄糖历程Fig. 2 Changes of fumaric acid, ethanol and glucose during simultaneoussaccharification and fermentation of corncob residue

2.4 米根霉壳聚糖性能表征

2.4.1 脱乙酰度

米根霉壳聚糖的脱乙酰度采用酸碱滴定法测定，脱乙酰度的结果如图3所示。由图3可知，滴定前，壳聚糖溶液中含有过量的HCl，过量的HCl使用NaOH溶液滴定至中性，该过程中由于氢离子的大量减少导致电导率急剧下降。继续加入NaOH溶液，NaOH与壳聚糖盐酸反应，钠离子与氯离子的增加又使得电导率开始上升，出现电导率第一次跃升。当NaOH与壳聚糖盐酸反应结束后，继续滴定NaOH溶液，电导率随NaOH体积的增加再一次快速上升，出现第二次跃升[9]。两次电导率跃升对应的NaOH体积之差，可根据如下公式计算米根霉壳聚糖的脱乙酰度：

式中：m为壳聚糖质量，g；V为两次电导率跃升对应的0.05 mol/L NaOH体积之差。

由图3数据计算可得，米根霉壳聚糖的脱乙酰度为90%，这与曾哲灵等[18]从乳酸发酵后米根霉废菌体中提取的米根霉壳聚糖脱乙酰度相一致。

图3 米根霉壳聚糖脱乙酰度测定Fig. 3 Determination of deacetylation degree ofR. oryzae chitosan

2.4.2 黏 度

分别将商品壳聚糖和米根霉壳聚糖溶解于质量浓度为20 g/L的乙酸溶液，配制成20 g/L壳聚糖溶液，采用流变仪测定不同剪切速率下商品壳聚糖与米根霉壳聚糖溶液的黏度，结果如图4所示。由图4可知，商品壳聚糖的黏度随剪切速率的增大而平缓降低。而米根霉壳聚糖的黏度较小，且保持在恒定值，剪切速率的增大并未影响米根霉壳聚糖溶液的黏度。剪切速率上升至3 000 s-1时，商品壳聚糖的黏度保持为70 mPa·s左右，而米根霉壳聚糖溶液的黏度一直为2 mPa·s左右。在以往研究中，Pochanavanich等[19]从米根霉菌体中提取的壳聚糖黏度明显低于商品壳聚糖黏度。Kleekayai等[20]提取的米根霉壳聚糖黏度仅为3.1～6.1 mPa·s。本研究中米根霉壳聚糖溶液的黏度较低。

图4 不同剪切速率下的米根霉壳聚糖溶液的黏度Fig. 4 Viscosity of R. oryzae chitosan at differentshear rates

2.4.3 分子量

采用Ultrahydrogel TM 2000、TM 250和TM 120三柱串联测定商品壳聚糖和米根霉壳聚糖的分子量。采用不同相对分子量的标准葡聚糖回归标准曲线和方程，将商品壳聚糖和米根霉壳聚糖的洗脱体积代入方程，求得米根霉壳聚糖的重均分子量和数均分子量分别2 578和1 532 u，分子量分散系数为1.68；商品壳聚糖的重均分子量和数均分子量分别70.2和53.5 ku，分子量分散系数为1.31。米根霉壳聚糖的分子量显著低于商品壳聚糖的分子量。产富马酸米根霉壳聚糖的低分子量导致米根霉壳聚糖溶液表现为低黏度性质。

3 结 论

以玉米芯为碳源，米根霉同步糖化发酵生产富马酸，并采用碱法从米根霉菌体中提取真菌壳聚糖。米根霉以100 g/L玉米芯渣为碳源同步糖化发酵，富马酸质量浓度达到28.65 g/L，是50 g/L玉米芯渣的同步糖化发酵过程中富马酸质量浓度的1.95倍。高玉米芯渣质量浓度同步糖化发酵显著提高富马酸产量。采用碱法提取米根霉壳聚糖实现对米根霉废弃菌体的再利用。获得的米根霉壳聚糖脱乙酰度为90%，重均分子量和数均分子量分别2 578和1 532 u。米根霉壳聚糖的低分子量导致米根霉壳聚糖溶液的低黏度特性。本研究结果为木质纤维原料生物法联产富马酸和真菌壳聚糖提供成本较低的新途径。

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Co-productionoffumaricacidandfungalchitosanfromcorncobbysimultaneoussaccharificationandfermentationwithRhizopusoryzae

LI Xin, GU Ximei

(Jiangsu Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

The co-production of fumaric acid and fungal chitosan based on the simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of alkali-treated corncob residues was investigated at high solid loading. Cellulase hydrolysis with a higher corncob substrate concentration resulted in a higher substrate concentration of glucose, which was benefit for the production of fumaric acid byRhizopusoryzae. The SSF at 100 g/L substrate concentration of corncob byR.oryzaecould produce 28.65 g/L of fumaric acid, which was 1.95 times than that from SSF at 50 g/L substrate concentration. After SSF, fungal chitosan was prepared fromR.oryzaebiomass by alkaline process. The deacetylation degree ofR.oryzaechitosan was 90%. The viscosity ofR.oryzaechitosan (20 g/L) was 2 mPa·s. Weight-average molecular weight and number-average molecular weight ofR.oryzaechitosan were 2 578 u and 1 532 u, respectively, measured by gel chromatography. The results of this study can provide a cost-effective approach for co-production of fumaric acid and fungal chitosan by SSF usingR.oryzaefrom lignocellulosic materials.

Rhizopusoryzae; simultaneous saccharification and fermentation; lignocellulosic materials; co-production; fumaric acid; chitosan

2017-04-22

2017-06-22

江苏省高校自然科学研究重大项目(14KJA220003)；江苏省重点研发计划(BF2015007)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)。

李鑫，男，副教授，研究方向为生物化工。E-mail:xli@njfu.edu.cn

TQ35

A

2096-1359(2017)06-0097-06