中药对多重耐药铜绿假单胞菌外排泵的作用研究

王淋荆 曾建明 鲁洋 蓝锴 罗强 林冬玲 张伟铮 陈茶★

中药对多重耐药铜绿假单胞菌外排泵的作用研究

王淋荆1，2曾建明1鲁洋1蓝锴1罗强1林冬玲1张伟铮1陈茶1★

目的 研究中药与常用抗生素的相互作用和对多重耐药铜绿假单胞菌（multi drug resistantPseudomonas aeruginosa，MDR⁃PA）外排泵的作用。 方法 采用外排泵抑制剂联合纸片扩散法（Kirby⁃Bauer，K⁃B）筛选外排泵阳性 MDR⁃PA，并用实时荧光定量 PCR（real⁃time fluorescence quantitative PCR，qPCR）确认外排泵基因高表达菌株。检测10种常用中药对抗生素的作用和对外排泵阳性MDR⁃PA外排泵基因表达的影响。 结果 从34株MDR⁃PA中筛选到5株外排泵阳性菌，qPCR法检测到这5株菌外排泵基因的表达水平是野生型铜绿假单胞菌PAOl的2倍或2倍以上（P＜0.05）。黄芩、金银花和夏枯草对环丙沙星有较强的拮抗作用，穿心莲和五倍子对庆大霉素的拮抗作用最强，穿心莲和夏枯草对美罗培南的协同作用最强。穿心莲、金银花、夏枯草和五倍子具有促进外排泵基因表达的作用。 结论 中药穿心莲、金银花、夏枯草和五倍子可通过促进外排泵基因的表达拮抗抗生素的抗菌作用，临床抗感染治疗时需谨慎使用。

铜绿假单胞菌；多重耐药；外排泵；穿心莲；金银花；夏枯草；五倍子

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是非发酵革兰阴性杆菌，为院内感染的主要病原菌之一［1］。近年来，由于喹诺酮类和碳青霉烯类等抗生素的广泛应用，临床多重耐药铜绿假单胞菌（multiple⁃drug resistantPseudomonas aeruginosa，MDR⁃PA）的分离率逐年增高，给抗感染治疗带来很大困难［2⁃3］。PA 产生耐药性的机制复杂，包括抗生素靶位改变、灭活酶产生、生物膜形成和主动外排系统过度表达等［4⁃5］。外排系统过表达可将进入细菌体内绝大部分的抗生素外排，介导产生高水平的耐药［6⁃7］。而外排泵抑制剂苯丙氨酸⁃精氨酸⁃β 萘酰胺（phe⁃arg⁃β⁃naphthylamide，PAβN，即MC⁃207110）能够有效地抑制外排泵活性［8］，可恢复 MDR⁃PA 对于环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）和美罗培南（meropenem，MEM）的敏感性［9］。

中药是我国传统医药的重要组成部分，现代研究已证实多种中药具有抗菌抑菌的作用［10］。由于中药的种类繁多，单味中药成分复杂，中药与抗生素的相互作用和机制尚不清楚。本研究从34株临床分离的MDR⁃PA中筛选出外排泵过表达的菌株，确定其耐药表型。选择10种常用的中药制成水煎液，研究其与常用抗生素的相互作用和对MDR⁃PA外排泵的作用，为临床抗感染治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 菌株

34株MDR⁃PA分离自2016年2月至7月间广东省中医院大学城医院门诊及住院患者送检的痰液、尿液和胸腔积液等标本，野生型铜绿假单胞菌PAO1由重庆医科大学附属儿童医院邹琳教授惠赠。

1.2 试剂

外排泵抑制剂PAβN购自美国Sigma公司；CIP 10 μg、MEM 15 μg、庆大霉素（gentamicin，CN）120 μg、红霉素（erythromycin，E）5 μg，药敏纸片购自赛默飞世尔科技有限公司；抗生素（CIP、MEM）、LB（lysogeny broth，LB）培养基和水解酪蛋白（muller hinton，M⁃H）平板均购自上海生物工程股份有限公司；荧光染料SYBR Premix Ex TaqⅡ和逆转录试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 药敏实验

微量肉汤倍比稀释法：分别挑单个菌落接种入3 mL LB液体培养基，37℃200 r/min摇至对数生长期，取100 μL加入96孔板，使每孔菌液为5×104CFU；采用倍比稀释法将抗生素由256 μg/mL稀释至 0.25 μg/mL，取 100 μL 加入 96 孔板；37℃孵箱培养18 h，根据2016年美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准判断结果［11］。

1.4 外排泵表型阳性菌株的筛选

制备添加PAβN（终浓度50 μg/mL）的M⁃H平板［12］，纸片扩散法（kirby⁃bauer，K⁃B）检测 34 株MDR⁃PA对CIP、MEM、CN和E药敏纸片的抑菌环直径，以未加PAβN的M⁃H平板做对照，根据CLSI 2016年标准，结果由耐药变为敏感或中介，判断为外排泵表型阳性菌株。

1.5 qPCR检测所筛选菌株外排泵相关基因表达水平

分别取外排泵表型阳性菌株单个菌落至3 mL LB液体培养基，37℃200 r/min增菌至对数生长期。收集1.5 mL菌液离心，加入RNAiso Plus提取RNA，逆转录为cDNA，采用SYBR Green染料法定量检测Mex⁃AB、Mex⁃CD、Mex⁃EF基因表达量，以rpoD为内参基因，引物序列见表1。qPCR条件：98℃ 8 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，循环40次。

表1 外排泵基因引物序列Table 1 The primers of efflux pump gene

1.6 中药制备

黄芩、黄连、黄柏、金银花、夏枯草、五倍子、射干、苍术、穿心莲和鱼腥草均购自康美药业股份有限公司。中药饮片各120 g分别用水煎2次，头煎30 min，二煎20 min。根茎类中药饮片头煎加水840 mL，二煎加水720 mL。花、叶、全草类中药饮片头煎加水1200 mL，二煎加水960 mL。取2次水煎液混合后纱布过滤，60℃旋转蒸发浓缩至120 mL，即得生药1000 mg/mL的中药水煎液，用0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃储存备用［13］。

1.7 中药对抗生素抑菌作用的影响

将10种中药水煎液分别加入M⁃H琼脂内，制成含中药的M⁃H平板（射干、穿心莲、黄连、黄柏、黄芩的低、高浓度分别为2、20 mg/mL；鱼腥草、金银花、苍术、夏枯草的低、高浓度分别为1、10 mg/mL；五倍子的低、高浓度分别为0.2、2 mg/mL），采用K⁃B法检测PAO1及外排泵阳性菌株对抗生素纸片CIP、MEM、CN和E的抑菌环直径，以不加中药水煎液的M⁃H平板为对照，观察抑菌环的变化。

1.8 中药对外排泵基因表达水平的影响

挑取外排泵阳性菌株单个菌落至3 mL LB液体培养基内，37℃200 r/min过夜增菌，二次增菌至对数生长期，分别设置空白对照组、CIP干预组［以各菌株的亚MIC（minimum inhibitory concentra⁃tion）浓度处理］、中药干预组（金银花、夏枯草的低、高浓度分别为10、20 mg/mL；五倍子的浓度为2 mg/mL）、CIP和中药联合干预组（提前1 h加入各菌株的亚MIC浓度CIP干预），各组细菌37℃静置培养2、4 h后分别收取菌液，qPCR检测外排泵相关基因表达水平（方法同1.5）。

1.9 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 34株MDR⁃PA药敏试验结果

采用微量肉汤稀释法检测临床分离的34株mRPA的药敏，根据2016年CLSI判断标准，34株PA均为CIP、MEM耐药株，结果见表2。

表234株MDR⁃PA对CIP和MEM的MIC分布情况Table 2 The MIC distribution of CIP and MEM in 34 strains of MDR⁃PA

2.2 外排泵表型阳性菌株筛选结果

添加 PAβN（50 μg/mL）后，34株 MDR⁃PA 对CIP、MEM、CN和E的抑菌环直径变大，其中MEM的抑制环直径变化范围为0～23 mm，中位数为11 mm。对MEM由耐药变为敏感的PA有24株；对CIP由耐药变为敏感的PA有7株，两者交集的菌株有5株（PA8、PA11、PA14、PA29和PA36），确定为外排泵表型阳性菌株。

2.3 qPCR检测所筛选菌株外排泵相关基因表达

以PAOl为对照，5株MDR⁃PA中每株菌的外排泵基因MexA、MexC、MexE中至少有一个的表达水平是PAOl的2倍或2倍以上，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见图1。

图1 外排泵阳性菌株外排泵基因表达量Figure 1 Expression of efflux pump gene in positive strains of efflux pump

2.4 中药对抗生素抑菌作用的影响

通过K⁃B法检测的高浓度中药组（tcmhigh）与低浓度中药组（tcmlow）所测抑菌环直径差值来判断中药与抗生素的作用关系，如果抑菌环直径差值小于零，提示中药与抗生素的作用为拮抗作用，反之为协同作用。从表3中可见，所用的10种中药对CIP均表现为拮抗作用，其中黄芩、金银花和夏枯草的拮抗作用最强。10种中药除鱼腥草外均对CN表现为拮抗作用，其中穿心莲和五倍子的拮抗作用最强。穿心莲、夏枯草和五倍子对MEM具有协同作用，其中穿心莲的协同作用最强。各种中药对E几乎没有影响。

进一步分析发现，中药几乎不影响PA29的抑菌环直径；五倍子对PA36、黄芩对PA11、穿心莲和夏枯草对PA14、穿心莲和五倍子对PA8的抑菌环直径有显著影响，结果见表4和图2。

表3 中药对抗生素抑菌作用的影响（最大值/最小值，mm）Table 3 Effect of traditional Chinese medicine on bacteriostasis of antibiotics（Maximum/Minimum，mm）

表4 MDR⁃PA对中药与抗生素的反应（最大值/最小值，mm）Table 4 The reactions of MDR⁃PA to traditional Chinese medicine and antibiotics（Maximum/Minimum，mm）

图3 qPCR检测中药对外排泵基因表达的影响Figure 3 The effect of traditional Chinese medicine on efflux pump gene expression by qPCR

2.5 中药对外排泵基因表达的影响

从中药对外排泵阳性菌株抑菌环直径影响较大的处理组中，分别选出中药穿心莲、夏枯草、金银花和五倍子，菌株PA8、PA11和PA36，分组处理后采用qPCR法检测外排泵基因的表达情况。从图3可见，夏枯草、金银花和五倍子均能显著增加MDR⁃PA外排泵基因的表达。穿心莲处理2 h已能促进PA8的MexC和MexE的表达，4 h时更明显；在CIP作用下，穿心莲能明显增强MexC和MexE的表达，4 h时表达水平回落；2 h时，穿心莲主要引起PA11MexE表达增强。夏枯草对PA8的MexA、MexC和MexE表达无明显影响；在CIP作用下，夏枯草处理2 h能显著提高各基因的表达水平，尤其是MexE（P＜ 0.001）。对PA36，夏枯草单独或联合CIP的作用相似，主要引起MexE表达增高。在干预4 h的情况下五倍子能使PA11外排泵MexC、MexE基因表达量分别增强123倍和79倍。CIP对各菌株MexA、MexC和MexE的影响不大。空白对照组、CIP处理组、中药处理组、CIP与中药联合处理组间外排泵基因表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

外排泵基因过表达是PA多重耐药的重要机制之一。PA外排泵由3部分组成：①内膜蛋白，如MexB、MexD、MexF、MexY，为主要的泵出蛋白，具有识别底物的作用，但不具特异性；②膜融合蛋白或连结蛋白，如 MexA、MexC、MexE、MexX，连接内、外膜蛋白；③外膜蛋白，如OprM、OprJ、OprN，形成门通道，有利于底物通过外膜。目前研究最多的PA外排泵分子分别是MexAB⁃OprM、MexCD⁃OprJ和 MexEF⁃OprN，均属于耐药小结节 分裂（resistance⁃nodulation⁃division，RND）家族［5，7］。PAβN是经典的RND型外排泵抑制剂，能够竞争性的与外排泵相应位点结合阻止抗生素外排，使菌株对抗生素的MIC值降低，提高菌株对于抗生素的敏感性。研究发现PAβN能够将多粘菌素敏感的MDR⁃PA的MIC值降低四倍以上［15］。根据文献报道的外排泵对应的底物，本实验以CIP筛查MexEF⁃oprN，MEM筛查MexAB⁃oprM，CN筛查MexXY⁃OprM，E 筛查 MexCD⁃oprJ［14］，采用外排泵抑制剂联合K⁃B法从表型上筛选外排泵阳性MDR⁃PA，用于后续中药对MDR⁃PA外排泵的作用研究。

本研究发现，PAβN能提高MDR⁃PA对于抗生素的敏感性，与文献报道一致［8］。以CIP和MEM联合PAβN从34株MDR⁃PA中筛选到5株外排泵阳性MDR⁃PA。基因水平的研究发现这5株菌的MexA表达均显著高于野生株PAO1，并且各菌株还伴有MexC和/或MexE基因高表达，提示外排泵基因高表达是导致PA多药耐药的重要机制，筛选到的MDR⁃PA菌株外排泵基因表型与外排泵表型一致。

中药具有一定的抗菌作用，但是中药与抗生素的作用和作用机制尚不清楚。本文根据文献［16⁃17］和课题组前期结果，从清热解毒药及收涩药中遴选了10味中药，通过K⁃B法检测的高浓度中药组与低浓度中药组所测抑菌环直径差值来判断中药与抗生素的作用关系，如果抑菌环直径差值小于零，提示中药与抗生素的作用为拮抗作用，反之为协同作用［18］。实验结果发现中药与抗生素的相互作用主要表现为拮抗作用，黄芩、金银花和夏枯草对环丙沙星有较强的拮抗作用，穿心莲和五倍子对庆大霉素的拮抗作用最强（见表4）。

杨祚明等［19］发现哌拉西林/他唑巴坦能降低PA对CIP、MEM等抗生素的MIC值，并能降低MexA、MexX基因的表达水平。而本文发现夏枯草、金银花、五倍子、穿心莲单独或联合CIP均能不同程度地促进MDR⁃PA外排泵基因表达，尤其是MexC、MexE基因表达变化最为显著，提示中药通过促进外排泵基因表达发挥拮抗抗生素的作用。与抗生素哌拉西林/他唑巴坦降低外排泵基因MexA、MexX表达发挥抗菌作用相比，中药导致MDR⁃PA外排泵基因表达水平升高，可能是中药不能抑制MDR⁃PA的原因。

随着中西医结合的深入发展，中西药联合应用已日趋普遍。一般认为，中药药性平和，毒副作用小且不易产生耐药性，与西药联用可增强疗效。但本实验从表型和基因水平的研究结果表明，中药穿心莲、金银花、夏枯草和五倍子可通过促进外排泵基因的表达拮抗抗生素的抗菌作用。因此，盲目联用中药和抗生素，可能会对抗生素产生拮抗，降低疗效，临床抗感染时抗生素与中药的联用需谨慎。

［1］ Afolabi OA，Salaudeen AG，Ologe FE，et al.Pattern of bacterial isolates in the middle ear discharge of pa⁃tients with chronic suppurative otitis media in a tertiary hospital in north central nigeria［J］.Af Health Sci，2012，12（3）：362⁃367.

［2］ Goncalves IR，Dantas RCC，Ferreira ML，et al.Car⁃bapenem ⁃resistant pseudomonas aeruginosa：associa⁃tion with virulence genes and biofilm formation［J］.Braz J Microbiol，2017，48（2）：211⁃217.

［3］ Agnello M，Wong⁃beringer A.Differentiation in quino⁃lone resistance by virulence genotype in pseudomonas aeruginosa［J］.Plos One，2012，7（8）：e42973.

［4］ Heydari S，Eftekhar F.Biofilm formation and β ⁃lac⁃tamase production in burn isolates of Pseudomonas ae⁃ruginosa［J］.Jundishapur j microbiol，2015，8（3）：e15514.

［5］ Kiser TH，Obritsch MD，Jung R，et al.Efflux pump contribution to multidrug resistance in clinical isolates of pseudomonas aeruginosa［J］.Pharmacotherapy，2010，30（7）：632⁃638.

［6］ Tian ZX，Yi XX，Cho A，et al.CpxR activates Mex⁃AB⁃OprM efflux pump expression and enhances antibi⁃otic resistance in both laboratory and clinical nalB⁃type isolates of pseudomonas aeruginosa［J］.Plos Patho⁃gens，2016，12（10）：e1005932.

［7］ Aygul A.The importance of efflux systems in antibiot⁃ic resistance and efflux pump inhibitors in the manage⁃ment of resistance［J］.Mikrobiyoloji Bulteni，2015，49（2）：278⁃291.

［8］ Lamers RP，Cavallari JF，Burrows LL.The efflux in⁃hibitor phenylalanine⁃arginine beta⁃naphthylamide（PAβN）permeabilizes the outer membrane of gram⁃negative bacteria［J］.Plos One，2013，8（3）：e60666.

［9］ Adabi M，Talebi⁃taher M，Arbabi L，et al.Spread of efflux pump overexpressing⁃mediated fluoroquinolone resistance and multidrug resistance in pseudomonas ae⁃ruginosa by using an efflux pump inhibitor［J］.Infec⁃tionamp;chemotherapy，2015，47（2）：98⁃104.

［10］ Zhou XZ，Jia F，Liu XM，et al.Total alkaloids of so⁃phorea alopecuroides⁃induced down⁃regulation of AcrAB⁃ToLC efflux pump reverses susceptibility to ciprofloxacin in clinical multidrug resistant Escherichia coli isolates［J］.Phytotherapy Research，2012，26（11）：1637⁃1643.

［11］ Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.M100S.Performance standards for antimicrobial sus⁃ceptibility testing：twenty⁃sixth edition［M］.CLSI.2016.

［12］ Lamers RP，Cavallari JF，Burrows LL.The efflux in⁃hibitor phenylalanine⁃arginine beta⁃naphthylamide（PAβN）permeabilizes the outer membrane of gram⁃negative bacteria［J］.Plos One，2013，8（3）：e60666.

［13］ 陈士林，刘安，李琦，等.中药饮片标准汤剂研究策略［J］. 中国中药杂志，2016，41（8）：1367⁃1375.

［14］ Masuda N，Sakagawa E，Ohya S，et al.Substrate specificities of MexAB⁃OprM，MexCD⁃OprJ，and MexXY⁃oprM efflux pumps in pseudomonas aerugino⁃sa［J］.Antimicrob Agents Chemother， 2000， 44（12）：3322⁃3327.

［15］ Ni WT，Li YJ，Guan J，et al.Effects of efflux pump inhibitors on colistin resistance in multidrug⁃resistant Gram ⁃negative bacteria［J］.Antimicrob Agents Ch，2016，60（5）：3215⁃3218.

［16］ 蓝锴，梁文君，张伟铮，等.三种中药对多重耐药铜绿假单胞菌抑菌作用研究［J］.现代医药卫生，2014，23（18）：2728⁃2729

［17］ 刘华钢，申庆荣，刘丽敏.中药抗菌研究进展［J］.时珍国医国药，2010，21（2）：463⁃465.

［18］ 林冬玲，陈茶，曾建明.铜绿假单胞菌耐药机制研究进展［J］. 现代检验医学杂志，2011，26（3）：91⁃95.

［19］ 杨祚明，谭孟源，符春花，等.哌拉西林他唑巴坦对多重耐药铜绿假单胞菌外排泵表达的影响［J］.中国临床药理学杂志，2016，32（17）：1572⁃1576.

Study on the effect of traditional Chinese medicine on efflux pump of multi⁃drug resistantPseudomonas aeruginosa

WANG Linjing1，2，ZENG Jianming1，LU Yang1，LAN Kai1， LUO Qiang1， LIN Dongling1，ZHANG Weizheng1，CHEN Cha1★
（1.Department of Laboratory Medicine，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong，China，510006；2.Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong，China，510006）

Objective To study the effect of traditional Chinese medicine on efflux pump ofPseudomonas aeruginosawith multiple drug resistance(MDR⁃PA). Methods Kirby⁃Bauer(K⁃B)test and real⁃time fluorescence quantitative PCR(qPCR)were used to screen positive bacteria of efflux pump in MDR⁃PA.The effect of 10 kinds of traditional Chinese medicine on the role of antibiotics and the expression of efflux pump genes positive MDR⁃PA were detected. Results 5 strains of efflux pump positive bacteria were screened from 34 strains of MDR⁃PA,and the expression level of efflux pump gene was 2 times or more than that of wild type Pseudomonas aeruginosa(P＜0.05).Scutellaria,honeysuckle and prunella have strong antagonism against ciprofloxacin,andrographis paniculata and gallnut have the strongest antagonism against gentamicin,and andrographolide and prunella have the strongestsynergistic effecton meropenem.Andrographis paniculata,flos lonicerae,prunella vulgaris and gallnut chinensis have the function of promoting the gene expression of efflux pump. Conclusions Andrographis paniculata,flos lonicerae,prunella vulgaris and gallnut can antagonize the antibiotic effect by promoting the expression of efflux pump gene,and use caution in clinical anti⁃infection treatment.

Pseudomonas aeruginosa;Multiple⁃drug resistant;Efflux pump;Andrographis paniculata;Honeysuckle;Prunella vulgans;Gallnut

广东省科技计划项目（2014A020212281，2016A020215236）；广东省中医院拔尖人才专项（2014KT1491）

1.广东省中医院检验医学部，广东，广州510006

2.广州中医药大学第二临床医学院，广东，广州510006

★通讯作者：陈茶，E⁃mail：chencha906@163.com

王淋荆和曾建明为并列第一作者