亲子鉴定技术在遗传学实验教学中的应用

牛东红，沈玉帮，汪桂玲，白志毅

摘要：在遗传学实验教学中，亲子鉴定实验是对遗传学基本定律的实际应用。该实验利用微卫星分子标记分析了海产贝类缢蛏家系的亲本和子代的基因型，确定了样本间的亲缘关系，深入理解了孟德尔定律的内涵。该实验是一个综合性实验，不仅锻炼了学生分子生物学技术的实际操作能力，更加培养了学生的科研思维和创新能力，是科研成果转化为教学实验的成功案例。

关键词：遗传学实验；亲子鉴定；微卫星；科研成果

中图分类号：G642.0；Q3 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）46-0247-03

遗传学是生物类和农学类专业重要的基础课程，以理论和实验相结合为特点，是一门实践性较强的学科[1]。遗传学实验是遗传学课程教学的必要组成部分，而遗传学实验仍然停留在传统的实验课程和设计，以验证性和示范性实验为主，实验对象主要集中在染色体水平。在高等教育阶段，以培养学生严谨的科研思维和提高主观能动性为主，因此遗传学实验的设计可以紧密结合科学研究，将科研成果带入课堂，培养具有创造力的科研人才[2]。

亲子鉴定也称亲权鉴定，是指通过对子代个体遗传特征的分析确定可能的父母，或通过父母的遗传特征来寻找可能的子女[3]。在水产生物家系选育的过程中，亲子鉴定技术可以对早期家系混养的个体进行有效的亲缘关系判定[4]。微卫星标记，由于其共显性和高重复性特点[5]，在遗传分析中占有重要地位。我们将利用微卫星标记进行亲子鉴定的实验引入了遗传学实验中。本实验设计了利用6对微卫星标记进行缢蛏亲本和子代个体间亲缘关系鉴定，是一个综合性实验。

一、实验原理

微卫星（Microsatellites）以1-6个碱基为单位进行串联重复，两侧的单拷贝序列较为保守，标记符合孟德尔遗传特性，是一种理想的共显性分子标记。根据孟德尔遗传定律，子代分别遗传父本和母本的一个等位基因，对于不符合孟德尔遗传规律的个体，便可排除在外。因此，通过分析亲代和子代的微卫星标记的长度变异，可以有效进行亲子鉴定。通过该实验，熟悉实验过程和分析技术，掌握亲子鉴定的原理与技术，深入理解孟德尔定律的内涵。

二、实验材料与方法

1.实验材料。在缢蛏繁殖季节，以一对一交配的方式构建家系。交配结束，取亲本个体外套膜分别浸泡于无水乙醇中保存。次年，每个家系随机采集30个子代，取其外套膜组织，保存在无水乙醇中，备用。

2.DNA提取。缢蛏基因组DNA的提取采用改良的酚氯仿抽提法。取0.2g缢蛏样本组织剪碎，溶解于裂解液中，彻底裂解至澄清；在裂解液中加入500uL苯酚，12000rpm离心20min；吸取上清液，加入500uL氯仿，12000rpm离心20min；吸取上清液，加入2倍体积预冷无水乙醇，静置20min，12000rpm离心15min；弃掉上清液，将DNA溶解于100uL无菌水中，-20℃保存备用。

3.PCR扩增。用于缢蛏个体亲子鉴定的微卫星引物6对，合成5′上游荧光引物（FAM）（表1）。PCR反应体系为25μL，含1×Taq Master Mix，上、下游引物各0.2μmol/mL，模板DNA 20ng；PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35循环，最后72℃延伸10min。

4.琼脂糖凝胶电泳检测。配制1%的琼脂糖凝胶凝胶，检测DNA和PCR产物，通过凝胶成像系统观察结果并拍照。

5.毛细管电泳检测基因型。将PCR样品进行毛细管电泳检测，利用GeneMapper v4.0对微卫星的分型结果进行分析。

三、实验结果

本实验包含了核酸提取，PCR扩增，凝胶电泳初步检测以及毛细管电泳基因分型；采集的样本包括1对父母本和10个子代。实验中将学生分为6组，每组同学分别提取2个样本的DNA，之后每组同学对12个样本进行2对微卫星引物的PCR扩增和基因型检测。

1.琼脂糖凝胶电泳检测结果。本实验对于微卫星引物扩增产物的检测，进行了琼脂糖凝胶电泳的初步检测，保障实验中能够扩增出预期的产物（图1）。但是，由于凝胶电泳分辨率较低，而微卫星等位基因片段差异较小，需要进一步根据采取分辨率较高的检测方法。

2.毛细管电泳检测结果。本实验设计了荧光标记的微卫星单向引物，采用了毛细管电泳检测方法，对PCR产物进行了进一步检测，利用GeneMapper软件获得了样本的测试峰图和基因型，并转化成扩增产物的长度表示。以引物以M129857为例，测序结果的数据如图2所示，分别为母本、父本和10个子代的基因型。该引物可以获得4种基因型，假设母本为ab，父本为cd，那么根据孟德尔定律，这10个子代的基因型必然是4种组合，包括ac，ad，bc和bd。学生通过对比各个微卫星引物扩增产物在父母本和子代个体中的片段大小，可以推断出它们之间的亲缘关系。

四、实验教学总结

在高等教育阶段，教学和科研是相辅相成，相互补充的。教学是科研的理论基础，而科研是教学的实践、补充和延伸。本实验中，我们利用了6对微卫星分子标记进行亲子鉴定实验，实现了科研成果的转化，也是对孟德尔定律的再次理解和实际应用。在传统的遗传学实验中，以掌握实验方法为出发点，大家在实验过程中仅僅是照搬实验步骤和机械性重复，缺乏主观能动性。本实验的不同在于是一个科学性的综合性实验，具有一定生物学意义，具备了“提出问题、解决问题和分析问题”的思路，相当于一个小课题。因此，在实验过程中，较好地激发了学生的学习兴趣，能够培养学生严谨的科学思维。

本实验属于综合性实验，涉及到了基本的分子生物学技术，也进行了实验和分析技术的改进。例如，对于传统的核酸抽提，我们进行了步骤简化，这样就可以节约时间。采用琼脂糖凝胶电泳抽测，对PCR结果进行初步检测，之后主要采用毛细管电泳检测方法，保证基因分型更加精确。对于整个实验，注重遗传学分析即基因型的判断，更加深刻理解遗传的本质。

总之，学生科研思维和创新能力的培养是现代高等教育的重要方向，我们将不断调整实验教学方案，构建完善的实验教学体系，培养高素质的科研人才。

参考文献：

[1]吴燕华，卢大儒，林娟，等.案例式教学在遗传学课堂中的运用与效果分析[J].高校生物学教学研究：电子版，2013，3（2）：25-28.

[2]蔡梅红，刘天磊，王云，段玉清.基于遗传学实验教学改革的大学生科研素质培养探索[J].安徽农业科学，2015，（01）：310-311.

[3]Gao H，Kong J，Yu F，Wang WJ，Luo K，Meng XH，Liu P，Zhang TS.The Chinese shrimp paternal recognition in conditions of artificially control and natural JiaoWei using microsatellite[J]. Mar Fisher Res，2007，28（1）：1-5.

[4]苗贵东，杜民，杨景峰，等.大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR技术建立及应用[J].中国海洋大学学报自然科学版，2011，41（1）：97-106.

[5]Tautz D，Renz M.Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，12（10）：4127-4138.