花椒挥发油的提取及其抑菌抗虫活性测定

王珊珊 吴昊 李梁

（沈阳工学院 生命工程学院，抚顺 113122）

花椒挥发油的提取及其抑菌抗虫活性测定

王珊珊 吴昊 李梁

（沈阳工学院 生命工程学院，抚顺 113122）

本实验研究了不同溶剂对花椒挥发油的提取效果，进行了花椒挥发油对不同菌种的抑菌实验，并探究了其对棉铃虫幼虫的拒食性和忌避性。实验结果表明：当乙醚作为提取剂时，提取率最高为8.77%；对不同菌种的抑菌效果无明显差别；乙醚提取的花椒挥发油对棉铃虫幼虫在拒食率及忌避率上均优于其他溶剂所提取的挥发油，对棉铃虫幼虫有着更好的抑制力。

花椒挥发油；棉铃虫；拒食性；忌避性；抗菌活性

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim），为芸香科花椒属落叶灌木或小乔木。原产地为中国，是中国特有的香辛料之一，果皮、种子、枝、叶均可入药，其药物功效在《神农本草经》和《本草纲目》中均有记载，并且在《中华人名共和国药典》（2005版）中记载有“温中止痛，杀虫止痒”的功效［1-2］。卫生部于2002年确认了花椒为药食两用的原料。

花椒挥发油具有高度选择性，在施药条件下易于分解，无残留，无污染，与环境和谐，对人畜安全，对天敌生物没有毒性，且多数对害虫有引诱、忌避、拒食和生长调节等作用［3，4］。花椒挥发油在抗炎、抑菌杀虫、抗肿瘤等方面具有较强的药理活性［5-6］。蒋小龙等［7］发现，花椒挥发油对玉米、稻谷等在仓储过程中出现的害虫以及储粮中的曲霉和青霉具有一定的防治效果，因此，花椒在植物性杀虫剂方面也有广阔的开发前景。

棉铃虫是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，其幼虫主要蛀食蕾、花、铃，也取食棉花的嫩尖和嫩叶，形成孔洞和缺刻，造成无头棉，影响棉花的正常发育［18］，使棉花产量降低，损害农民利益。本研究以期得到一种绿色环保的天然抗虫剂，从而降低棉铃虫幼虫对棉花的蛀食，减少棉花的虫害，减少农民的损失。为花椒挥发油的综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 花椒 市售干品四川大红袍。

1.1.2 菌种及培养基 菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌，黑曲霉，灰曲霉，米曲霉。培养基：细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；霉菌培养基为PDA培养基。

1.1.3 主要仪器及试剂 主要仪器有索氏提取器，圆底烧瓶，冷凝管，电热套，恒温水浴锅，电子天平，超净工作台，高压蒸汽灭菌锅。使用的试剂无水乙醇，甲醇，乙醚，石油醚，无水硫酸钠均为分析纯。

1.1.4 受试昆虫 2-3龄棉铃虫幼虫。

1.2 方法

1.2.1 花椒挥发油的提取 采用索氏提取法［8］。将粉碎过的花椒粉末过20目筛后，称取10 g于滤纸筒中，并将其置于安装好的索氏提取器内，在圆底烧瓶内分别加入100 mL乙醚、石油醚、甲醇和无水乙醇这4种有机溶剂，并分别在45℃、65℃、70℃和85℃和各自回流4 h，收集提取液，再分别在34℃、60℃、64℃和78℃的水浴中挥干溶剂至恒重，得到挥发油。

1.2.2 得率计算与状态观察

花椒挥发油提取率=（M-M0）/10

其中，M（g）为挥发油连同容器重量；M0（g）为干燥容器重量。每次实验样品用量20 g。分别从颜色、气味、状态这3个方面对不同溶剂提取得到的挥发油进行感官评定并记录结果。

1.2.3 菌悬液的制备 取活化的菌株，向无菌的试管中加人无菌生理盐水，挑取1-2环大小适宜的菌群，制成浓度为105-106CFU/ml的菌悬液［9］。

1.2.4 抑菌实验 采用牛津杯法［10-12］。配置培养基灭菌后倒入已灭菌的培养皿冷却制成平板，将配置好的菌悬用无菌移液枪吸取200 μL后均匀涂布于培养基表面。将灭菌后的牛津杯置于已涂布有生长期受试菌种菌悬液的平板上，并向牛津杯中分别注入上一步实验中的4种挥发油并用相应无机溶剂作对照，分别于温箱中培养36 h后进行抑菌圈直径的测量，进行3组平行实验，求其平均值，单位mm。

1.2.5 拒食活性测定［13-15］采用小叶碟添加法。挑选生命力较强、大小均一的受试昆虫20条，隔离于锥形瓶中保持其饥饿状态5 h后，取出并将其置于洁净的培养皿中；将采摘的新鲜树叶裁剪成边长为1 cm的正方形叶碟，将其浸泡于有机溶剂稀释一倍的挥发油中1-2 s后取出，挥干溶剂后置于放有试虫的培养皿内，对照组将叶碟浸于相应有机溶液中1-2 s，取出后挥干溶剂并按照实验组操作。分别在6 h、12 h、18 h和24 h后观察测量拒食面积并计算拒食率，进行3组平行实验，求其平均值。公式如下：

拒食率（%）=［（对照组取食面积-处理组取食面积）/对照组取食面积］×100%

1.2.6 忌避活性测定［13，16］采用培养皿滤纸涂药法。裁剪与培养皿直径一致的圆形滤纸片，对折并在距离中线一毫米处将其剪成两片类似半圆状的滤纸片，其中一片用有机溶剂稀释过一倍的花椒挥发油浸泡处理并挥干溶剂；另一片用相应有机溶剂浸泡处理并挥干溶剂进行对照，两片滤纸片在互不接触的情况下用透明胶固定于培养皿底部，备用。

在培养皿中放入等量试虫，用湿润纱布盖好培养皿，在保证培养皿中氧气充足的情况下放置观察，并分别在3 h、6 h、9 h、12 h后观察试虫情况、计算忌避率，进行3组平行实验，求其平均值。公式如下：

忌避率（%）=［（对照虫数-处理虫数）/对照虫数］×100%

2 结果

2.1 不同溶剂提取花椒挥发油的得率与状态观察

分别选用4种不同的有机溶剂，按照1.2.1的方法进行提取并按照1.2.2的方法进行计算及状态观察。分别进行3次提取，求其平均值，平均提取率如图1所示。乙醚作为提取剂的提取率最高为8.77%，无水乙醇次之为7.93%，石油醚作为提取剂的提取率最低为5.37%，可见当乙醚作为花椒挥发油的提取剂时，可最大限度将花椒中的挥发油提取出来。

图1 四种溶剂对花椒挥发油提取率的比较

由表1可见，甲醇与乙醇的提取物性状比较相似，均为深褐色，原因可能为两种有机溶剂形状相似，所提得挥发油组成成分亦比较相似，而乙醇提取挥发油成浸膏状的原因可能为乙醇沸点相对较高，在提取和分离的过程中可能由于高温而导致挥发油发生一定程度的氧化［17］，从而使其性状发生改变；乙醚与石油醚提取挥发油的形状相似，均为淡色透明液体。石油醚和无水乙醇的提取液在分离溶剂后仍留有轻微溶剂味，可能是提取过程中挥发油中部分组成成分与溶剂发生轻微反应导致。

表1 不同溶剂提取花椒挥发油的状态观察

2.2 抑菌活性比较

用牛津杯法，测定了4种不同的有机溶剂提取花椒挥发油的抑菌活性，其结果见表2。各种溶剂提取的花椒挥发油都对细菌有着一定的抑制作用，其中，相比较而言，以乙醚的提取液抑制效果最佳且对各类菌均有较明显抑制效果，而抑制效果相对较差的为乙醇提取的挥发油。推测为乙醇提取的挥发油性状不佳，流动性不好，无法更大范围的抑制菌种生长。

表2 不同溶剂提取花椒挥发油的抑菌圈直径（cm）

2.3 抗虫活性比较

2.3.1 拒食活性测定 采用小叶碟添加法，测定了4种溶剂提得到的挥发油对棉铃虫幼虫的拒食活性。其结果见图2。

图2 不同溶剂提取的花椒挥发油对棉铃虫幼虫的拒食活性测定结果

由图2可见，各溶剂提取的挥发油均对试虫具有一定的拒食活性，而且效果较为明显，不过随着时间的推移，各实验组的拒食活性均有不同程度的降低，这是由于花椒挥发油存在挥发性，随着时间的增加挥发油浓度不断降低，拒食活性也随之减小。

2.3.2 忌避作用测定 采用培养皿滤纸涂药法。不同溶剂提取花椒挥发油对棉铃虫的忌避作用结果见图3至图6。棉铃虫对乙醚提取挥发油的忌避性始终较高，但同时会随着时间的推移有所下降（图3），其原因推测为随时间变化挥发油中的挥发性物质挥发掉，从而使其对昆虫的驱逐性逐渐降低；棉铃虫对石油醚提取的花椒挥发油一开始忌避性很高，但随着时间的不断增加，忌避性下滑很快直至不明显（图4），由此可见石油醚提取出的花椒精油极易挥发，并可推测出其提取的挥发油成分不全；棉铃虫对甲醇提取的花椒挥发油忌避性始终适中，并无明显下滑（图5），由此可得出结论：甲醇提取的挥发油不易挥发，可较长久时间保存；棉铃虫对无水乙醇提取的花椒挥发油忌避性普遍偏低（图6），结合挥发油性状可得出结论，无水乙醇提取的挥发油可能随乙醇的挥发加速花椒挥发油的挥发，使忌避率迅速下降。

综上所述，石油醚提取花椒挥发油忌避率波动范围最大，无水乙醇提取花椒精油其次，乙醚提取花椒精油忌避率波动范围最小且忌避率普遍偏高。

图3 棉铃虫对乙醚提取花椒挥发油忌避率测定结果

图4 棉铃虫对石油醚提取花椒挥发油忌避率测定结果

图5 棉铃虫对甲醇提取花椒挥发油忌避率测定结果

图6 棉铃虫对无水乙醇提取花椒挥发油忌避率测定结果

3 讨论

植物次生代谢物中对昆虫有拒食性和忌避性的物质主要有萜烯类、生物碱和酚类等物质［19］。昆虫的取食行为分为远距离定位，近距离降落和接触3个主要阶段，是一个由多种化学感受器参与，受神经系统控制完成的生理行为。根据功能分类，化学感受器分为嗅觉感受器和味觉感受器，嗅觉感受器远距离感知植物中挥发性的次生代谢物质，味觉感受器在与植物接触后感知植物中的营养成分和取食抑制剂的种类和数量［20］。棉铃虫幼虫的化学感受器对印楝素、肌醇和黑芥子苷敏感［21］。化学物质对昆虫的拒食作用可能通过影响昆虫口器上的感受器对营养物质的识别和刺激效应，进而引起昆虫厌食［22］。

在抗虫-拒食性和抗虫-忌避性试验中均出现受试昆虫意外死亡的情况，除却遭受意外碾压，同族相残等明确死亡方式外，还有少量试虫死因不明。查阅资料后发现花椒挥发油对黏虫幼虫和杨毒蛾幼虫均有一定程度的触杀作用，及对小菜蛾幼虫、黏虫幼虫、杨毒蛾幼虫均具有极强的熏蒸毒杀作用［23］。在试验过程中，虽已将对照组及实验组的滤纸片进行溶剂挥干处理，但并无法确定是否有少量残留，更无法确定该残留对虫体是否有类似“熏蒸性”的影响。因此并不排除花椒挥发油对其产生“触杀性”及“熏蒸性”的可能，但由于这一现象并不常见且出现频率不稳定，因此并未将“触杀性”及“熏蒸性”列入实验内容。

4 结论

本研究通过对不同有机溶剂索氏提取花椒挥发油得率比较试验可知，乙醚提取花椒挥发油得率最高且性状良好；不同溶剂提取花椒挥发油对不同菌种抑菌效果试验可知，4种溶剂提取的花椒挥发油对不同菌种抑菌效果无明显差别，对细菌普遍具有抑制性，但对霉菌的抑制性并不明显；不同有机溶剂提取花椒挥发油对棉铃虫抗虫性试验可知，乙醚提取花椒精油首先在拒食率上高于其他溶剂所提取的挥发油，又在忌避率上稳定且微高于其他溶剂所提取的挥发油，由此可得出结论，乙醚提取花椒挥发油对棉铃虫幼虫有着更好的抑制力。

［1］ 石雪萍. 花椒总生物碱镇痛、抗炎、止痒作用研究［J］. 中国野生植物资源2011, 30（1）：46-49.

［2］ 杜丽君. 花椒属植物的药理研究与展望［J］. 热带作物学报2013, 34（5）：995-999.

［3］ 董志坚, 程道全, 董顺德, 等. 植物源农药在烟草病虫害防治上的研究与应用［J］. 中国烟草学报, 2004, 10（4）：42-47.

［4］ Kestenholz C, Stevenson PC, Belmain SR. Comparative study of field and laboratory evaluations of the ethnobotanical Cassia sophera L. （Leguminosae）for bioactivity against the storage pests Callosobruchus maculatus（F. ）（Coleoptera ：Bruchidae）and Sitophilus oryzae（L.）（Coleoptera：Curculion）［J］. Journal of Stored Products Research, 2007, 43（1）：79-86.

［5］ 袁剑刚, 刘听, 汤展球. 橄榄的抑菌效应及其药效成分的初步研究［J］. 食品科学 , 2001, 22（3）：82-84.

［6］ 叶和杨, 马廉兰, 张瑞其, 等. 金边瑞香的抑菌试验［J］. 赣南医学院学报, 2002, 22（5）：470-471.

［7］ 蒋小龙, 寸东义, 杨晶焰. 香茅、花椒精油成分分析及对储粮曲霉和青霉熏杀效果的初步研究［J］. 粮食储藏, 1993（3）：13-19.

［8］ 刘芳, 邓修. 三种花椒籽油提取方法的分析与比较［J］. 中成药 , 2005, 27（4）：391-394.

［9］ 马绪荣, 苏德模. 药品微生物学检侧手［M］. 北京：科学出版社出版, 2000：70-74.

［10］ 梁盛年, 段志芳, 王志娟, 等. 香蕉皮中有机酸的提取及抑菌作用的研究［J］. 食品工业科技, 2007, 28（8）：73-75.

［11］ 李建慧, 马会勤, 陈尚武. 多酚抑菌效果的研究［J］. 中国食品学报, 2008, 8（4）；100-106.

［12］ 刘冬梅, 李理, 杨晓泉, 等. 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力［J］. 食品研究与开发. 2006, 7（3）：110-111.

［13］ 庄世宣, 花椒精油提取及其生物活性测定研究［D］. 杨凌：西北农林科技大学, 2002.

［14］ 陈振东, 黎柳锋, 曾宪儒, 秦健. 中药植物鸦胆子提取物对小菜蛾的拒食活性研究［J］. 安徽农业科学, 2015（13）：122-123.

［15］ 周天雄, 杨美, 林顾芳. 紫茎泽兰提取物对小菜粉蝶幼虫的拒食活性测定［J］. 云南农业大学学报, 2003, 18（3）：259-263.

［16］ 吴兰军, 李霜, 谢佼昕, 等. 绿薄荷茎和叶的乙醇提取物对小菜蛾拒食和产卵忌避活性的影响［J］. 植物保护学报, 2016,43（6）：1007-1013.

［17］ 罗凯. 水蒸汽蒸馏、溶剂萃取、同时蒸馏萃取法提取花椒挥发油的效果比较［J］. 食品科技2012, 37（10）234-240.

［18］ 李云瑞. 农业昆虫学［M］. 北京：高等教育出版社, 2006, 1：192-196.

［19］ 朱玉坤. 昆虫拒食剂研究进展［J］. 世界农药, 2012, 34（3）：28-30.

［20］ 杨慧, 严善春, 彭璐. 鳞翅目昆虫化学感受器及其感受机理新进展［J］. 昆虫学报 , 2008, 51（2）：204-215.

［21］ 汤清波, 马英, 黄玲巧, 等. 昆虫味觉感受机制研究进展［J］.昆虫学报, 2011, 54（12）：1433-1444.

［22］ Valzadeh B, Jalali J, Zibaee A, et al. Effect of Neem based insecticide Achook. On mortality, biological and biochemical parameters of elm leaf beetle Xanthogaleruca luteola Mull（Col：Chrysomelidae）［J］. Journal of Crop Protection, 2013, 2（3）：319-330.

［23］ 庄世宏. 花椒精油提取及其生物活性测定研究［D］. 杨凌：西北农林科技大学. 2002：28-35

Extraction of Volatile Oil from Zanthoxylum and Determination of Its Antibacterial Activity and Insect Resistance

WANG Shan-shan WU Hao LI Liang
（Shenyang Institute of Technology，School of Life Engineering，Fushun 113122）

Extraction effects of volatile oil from Zanthoxylum by different solvents were studied，then the experiment of its antibacterial activity was conducted，and the antifeeding and repellency of cotton bollworms to volatile oil from Zanthoxylum were investigated. The results of the experiment were as follows，the best extraction rate was 8.77% while using ether as solvent，and there was no significant difference on antibacterial activity between strains. The extracted volatile oil from Zanthoxylum by ether showed priority on antifeeding and repellency of cotton bollworm larvae than those by other solvents，thus it should have better inhibitory effects on the larvae.

volatile oil；cotton bollworms；antifeeding；repellency；antibacterial activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0412

2017-05-22

国家级大学生创新创业项目（201713201000003）

王珊珊，女，硕士研究生，研究方向：生化与微生物发酵；E-mail：shuihugai@163.com

（责任编辑 朱琳峰）