L-茶氨酸对H2O2损伤的瘤胃上皮细胞活性的影响

陈文，陈珍，杨光提，黄远强

（湖南省浏阳市畜牧兽医水产局，湖南浏阳410300）

L-茶氨酸对H2O2损伤的瘤胃上皮细胞活性的影响

陈文，陈珍，杨光提，黄远强

（湖南省浏阳市畜牧兽医水产局，湖南浏阳410300）

以体外分离培养的60日龄湘东黑山羊瘤胃上皮细胞作为试验材料，利用H202构建损伤模型，通过分别添加4、8、12和16mmol/L的L-茶氨酸溶液，来测定L-茶氨酸对瘤胃上皮细胞活性的影响。结果表明：L-茶氨酸的浓度在8～16mmol/L时能够显著增加的瘤胃上皮细胞的活性(P＜0.05)，并且随着添加浓度的增加其活性增加，且在24h时处理效果较好。由此可知，L-茶氨酸对H202损伤的湘东黑山羊瘤胃上皮细胞具有一定的保护作用。

L-茶氨酸；瘤胃上皮细胞；细胞活性

胃肠道的氧化应激主要是由两种应激通过产生自由基引起的，包括急性和慢性应激。长期应激会对动物机体造成很大的损伤，产生的自由基会造成特定维生素和微量元素的大量耗损，从而使畜禽的免疫力下降，进而造成机体的功能障碍甚至是诱发死亡[1]。研究表明，活性氧的产生能够诱发多种类型的胃肠疾病[2]。并且H2O2是引起胃粘膜细胞氧化损伤的主要活性氧。

绿茶作为一种养生性饮品，随着研究者对于其功能的逐步认知，目前已经得到广泛的关注[3]。天然的茶氨酸仅以游离的形式存在，并且主要是L型[4]。作为茶科植物中的主要活性成分，茶氨酸主要是借助氨基酸转运系统来完成在组织和细胞内的作用的，并且研究表明，茶氨酸对组织损伤具有一定的保护作用，例如脑组织[5-7]和肝组织[8-9]。

作为反刍动物特有的消化器官，瘤胃在反刍动物消化过程中起着决定性的作用。反刍动物能够高效的利用高纤维的饲料原料，离不开瘤胃的功劳。反刍动物的瘤胃功能完善和健康，能够保证反刍动物的正常生理活动。本试验借助构建的离体氧化损伤模型，通过添加不同浓度梯度的L-茶氨酸来分析其对湘东黑山羊瘤胃上皮细胞活性的影响，为更加全面的了解L-茶氨酸对瘤胃上皮受损的保护作用，探索其作用机制提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

分光光度计(BIO RAD680,美国)，二氧化碳培养箱（SELECTA，西班牙），倒置相差显微镜（Ol ympus，日本），高压蒸汽灭菌锅（SANYO，日本），超净工作台（SANYO，日本），水平摇床(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，H ZS-H)，鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）

1.2 试验试剂

胎牛血清（Cel l m ax）、基本培养基（Dul becco’s m odi f i ed eagl e m edi um∶nut ri ent m i xt ure F-12,DM EM/F12）、0.25%Trypsi n+0.02%EDTA、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、青霉素均购自（Gi bco,美国）；两性霉素B+庆大霉素（Gent am i ci n/am phot eri ci n Sol ut i on）购自 Therm o Fi shersci ent i f i c（R-015-10,10×1m L，美国）；L- 茶氨酸（L-t heani ne,CAS∶3081-61-6,纯度≥99%,H PLC）；3-（4,5- 噻唑 -2）-2,5- 二苯基四氮唑溴盐（M TT）、二甲基亚砜（DM SO）购自美国Si gm a公司。

1.3 细胞培养

试验选择4只60日龄（体重为8.2±0.8 kg）健康的湘东黑山羊。采用颈静脉放血的方法，待山羊死亡后即刻采取瘤胃组织，冲洗并弃内容物，后用生理盐水反复冲洗，干净后进行取样。对瘤胃上皮进行钝性剥离，浸泡于4℃含10倍双抗、5倍庆大霉素的DM EM-F12培养基中，转移至细胞培养室；组织用含5倍双抗的PBS液清洗3～5次；将组织尽量剪碎，加入0.25%胰酶消化液；37℃空气浴振荡消化，收集酶解液，加入适量完全培养基重悬细胞，依次经100μm孔径筛网过滤，收集滤液，1000 r/m i n离心5 m i n，去上清，将细胞重悬于DM EM/F12完全培养液中，并调整细胞浓度为1×106/m L，置于CO2培养箱，37℃，5%CO2培养。

1.4 试验方法

1.4.1 条件培养液的配制

将L-茶氨酸在完全培养基中进行充分溶解，使其终浓度达到32m m ol/L的浓缩液。处理时用完全培养基进行稀释，使最终的工作液分别为4m m ol/L、8m m ol/L、12m m ol/L、16m m ol/L 各 20m L。保存在4℃冰箱中备用。

1.4.2 细胞的分组及处理

当细胞密度达到80%～90%时，进行换液，用PBS对贴壁细胞进行冲洗，重复一次，加入1m L的胰蛋白酶消化细胞，放入恒温恒湿的CO2培养箱中消化4 m i n。倒置显微镜下观察，当所有细胞变亮、变圆且有部分细胞漂浮时，迅速用完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使其形成细胞悬液，吸取悬液进行离心1000 r/m i n 5 m i n，保留底部沉淀。随后用完全培养基使细胞重悬，相同比例接种在两个培养皿中。培养箱中放置1h，随后重吸细胞悬液，转移至新的培养皿中培养，重复接种过程一次，进一步纯化[10]。纯化后细胞可备用于试验处理，待细胞密度达到60%～70%时，分为6组，每组6个重复，分为对照组添加0、Ⅰ组 800 μm ol/L H2O2、Ⅱ组4m m ol/L L-茶氨酸+800 μm ol/L H2O2、Ⅲ组8m m ol/L L- 茶 氨 酸 +800 μm ol/L H2O2、 Ⅳ 组12m m ol/L L-茶氨酸 +800 μm ol/L H2O2和Ⅴ组16m m ol/L L-茶氨酸+800 μm ol/L H2O2，分别处理12、24、48h，随后PBS冲洗三遍,将M TT加入试验处理组各孔,并在培养箱中孵育4h,吸取上清液。后向每孔种添加150 μL DM SO,水平摇床中振荡10 m i n,570 nm波长测定其各孔的吸光度值。

2 数据处理与分析

试验数据采用SPSS 21软件进行分析，统计方法采用LSD法，对各水平间数据进行多重比较，试验结果以均值±标准误的形式进行呈现。

3 结果

3.1 不同浓度L-茶氨酸对H2O2诱导的受损瘤胃上皮细胞存活率的影响

本试验的研究目的，主要是围绕L-茶氨酸的保护机制来探索，探究其对受损瘤胃上皮细胞活性的影响。试验首先采用不同浓度水平(4、8、12、16m m ol/L)的L-茶氨酸来处理细胞，孵育1h后与H2O2(0.8 m m ol/L)共同培养24h。试验结果（图1）表明：瘤胃上皮细胞的活性对于H2O2的刺激很敏感(P＜0.01)。H2O2对细胞的损伤作用，只有在L-茶氨酸浓度不低于8m m ol/L的情况下才得到改善。当L-茶氨酸的孵育浓度达到8、12和16 m m ol/L时,其细胞活性分别为(62.43±8.21)%、(69.55±6.78)%、(76.44±7.42)%,与H 2O2单独添加组比较,显著增加 (P＜0.01)，由此可知，L-茶氨酸的浓度在8～16m m ol/L时能够显著改善受损的瘤胃上皮细胞的细胞活力。

图1 不同L-茶氨酸水平下瘤胃上皮细胞活性

3.2 不同浓度L-茶氨酸不同作用时间下H2O2诱导的受损瘤胃上皮细胞的存活率

试验结果如图2所示，处理浓度相同的情况下，时间处理不同组的细胞活性各组间差异不显著(P＞0.05)，然而与12h和48h处理组相比，24h处理组的细胞具有更好的活性，由此说明对于H2O2诱导的受损瘤胃上皮细胞，在L-茶氨酸处理24h时对细胞的保护性最强。

图2 不同浓度茶氨酸不同处理时间瘤胃上皮细胞活性

4 讨论

高浓度的活性氧能够作用于瘤胃上皮细胞，使相关疾病恶化，甚至是诱导细胞发生凋亡。作为引起细胞损伤的关键因素，氧化自由基的产生因素有很多，例如缺血再灌注、药物代谢，以及一些重金属引起的中毒[11]。氧化自由基的种类有很多，H2O2在占了很大的比例，也是目前研究最为广泛的自由基之一[12]。H2O2可导致细胞损伤的机制涉及的范围比较广，不仅会对通过作用线粒体和DNA来起到损伤作用，而且还可以对细胞内的蛋白和脂质进行氧化，同时消耗大量的ATP，对细胞造成损伤，甚至是诱导细胞发生凋亡[13]。

作为绿茶中天然存在的氨基酸，L-茶氨酸主要起着呈味的作用，并且已经广泛应用在食品行业。研究表明，L-茶氨酸不仅能够抗氧化，还能帮助神经细胞抵御外界的各种刺激[14]。目前对于茶氨酸对氧化应激诱导的受损瘤胃上皮细胞是否起作用，还鲜有文献报道。因为L-茶氨酸是由谷氨酰胺衍生而得的，在代谢过程中可以转化成谷氨酸，进而参加谷胱甘肽（GSH）的合成。除此之外，L-茶氨酸可以保护细胞内的抗氧化酶，减少GSH损耗的同时还能生成GSH，以维持细胞内GSH的稳态，保证细胞内氧化还原状态的正常运转，免受氧化应激造成的应激损伤[15]。

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S852.32

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10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.019

2017-09-19