香菇菌粗酶液对猪场雾霾中萘的作用研究

周孟清，贾 峰,张惠茹，宴和平 ，谢申伍，黄 进 ，罗 宇,阮婷婷

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001；2.广州快大饲料有限公司，广东广州511450;3.云南东恒集团生物饲料公司，云南曲靖655500）

香菇菌粗酶液对猪场雾霾中萘的作用研究

周孟清1，贾 峰1,张惠茹1，宴和平2，谢申伍3，黄 进1，罗 宇1,阮婷婷1

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001；2.广州快大饲料有限公司，广东广州511450;3.云南东恒集团生物饲料公司，云南曲靖655500）

近5年以来,我国雾霾污染十分严重，猪场也同受其害,雾霾中包括萘等有害物质危害猪和养殖人员的健康；以往的研究发现香菇菌分泌的漆酶等酶类可以降解多种有害物质。为研究香菇菌粗酶液对雾霾中萘的作用，以便为消除雾霾对人和动物的有害作用提供一些参考，文章首先采用L934正交实验，研究流速（0.6mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min），波长（210nm、220nm、254nm），柱温（25℃、30℃、40℃），有机相甲醇和水相之比（75:25、70:30、85:15）来确定高效液相色谱仪器检测雾霾中的萘的条件参数。然后采用L934正交实验，研究温度（35℃、40℃、30℃），酶处理时间（10h、20h、30h），pH（4.0、4.4、4.8），加入酶的量（5mL、10mL、15mL）对香菇粗酶液降解雾霾中萘的影响。结果发现：温度35℃,pH值4.0、处理时间10h、加入酶的量5mL为最适条件；在此条件下萘含量为2.08±2.95(pg·m-3)，降解前雾霾样品中的萘含量为0.217494ng·m-3，降解率达到99.04%。结论表明，香菇菌粗酶液可以降解雾霾中的萘，具有开发潜力。

猪场；雾霾；萘；香菇菌；粗酶液；高效液相色谱；降解

香菇(Lent i nusedodes)不仅是一种食用菌而且还具有很高的药用价值，其子实体中存在漆酶（Lac），它是一种非特异性氧化酶，能够氧化的底物有250种[1],包括木质素，漆酶氧化木质素的过程已有多种理论[2]，这些理论都认为氧化过程中会形成木质素自由基，使得单元结构之间的连接断裂,整个反应过程中是通过4个铜离子协同传递电子和其价态的变化来实现的[3]。

雾霾是由于大量悬浮在近地面的小水滴以及直径小于2.5μm的固体或液体颗粒组成的气溶胶系统，是近地面层空气中水汽和固体液体颗粒凝结的产物，能见度水平小于一千米则被称为雾霾或者灰霾。环境空气中当量直径小于或者等于2.5μm的颗粒物质叫做PM2.5[4]。雾霾颗粒的来源广，组成包括无机元素、水溶性离子、有机物、化合物等。有机质成份包括氮氧化合物（NOx）、NH3、烃（如甲烷）等[5]。萘属芳香族烃类是有特殊气味的白色结晶,易氧化,易挥发,萘对血液的损害已被公认[6];萘可以影响细胞遗传[7]。

雾霆天气加剧畜禽养殖场舍内空气环境恶化,畜禽出现食欲不振、疾病率提高等现象。研究畜禽养殖场雾霾中萘的生物降解，对防治雾霾和改善空气环境质量具有实际意义,可以为我国治理雾霾污染提供一种借鉴的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种∶香菇菌种购自中国菌种保藏中心。香菇菌粗酶液由本实验室制备保存；雾霾样品由大气颗粒物中流量采样器采集，TH-150型（武汉天虹仪器仪表有限公司），采样平均流量为100 L·m i n-1。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂：愈创木酚，化学纯；甲醇，色谱纯。琼脂粉，生化级试剂。丁二酸（琥珀酸）、柠檬酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、葡萄糖都是分析纯级别。

1.2.2 主要仪器：高效液相色谱仪（1260 Inf i ni t y,Agil entTechnol ogi es，配PAH专用柱）；AR224CN电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；便携式pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

1.3 正交试验设计

采用L934正交试验设计控制高效液相色谱仪的温度、波长、流速、有机相与水的配比来寻找分析雾霾溶液成份的最佳条件。之后，又通过L934正交试验控制粗酶液作用于雾霾样品的温度、pH、反应时间、加入的酶量，寻找香菇粗酶液降解雾霾样品中蒽的最适条件。

表1 雾霾检测条件的4因素3水平正交实验表

1.4 香菇粗酶的提取

PDA培养基以及倒平板与接种参照张玉（2006）的方法进行，将培养好的香菇菌充分碾碎，加入适量的蒸馏水在25℃的环境下泡4h，然后在3500r/m i n的离心机中离心5m i n，就得到香菇菌的粗酶液。

1.5 愈创木酚法测Lac的酶活

Lac活性的测定按照王鼎（2009）所述的方法进行测定，使用分光光度计测定吸光度。经过公式1：酶活（U/m L）=106×V总×ΔA/(V酶×ε×Δt)（式1）∶其中V总、V酶分别代表反应体系的总体积及反应酶液的体积；ε为吸光系数，愈创木酚的ε465=1.21×104m ol-1·L·cm-1)。算得香菇粗酶液中Lac的活性为8.0126U/m L。

1.6 雾霾样品中萘的测定

雾霾样品的含量采用高效液相色谱法进行检测，以甲醇和超纯水为有机溶剂，每次进样量为20 μL。采用 Agi l entPAH专用柱（3μm，100m m×4.6m m）。用L934正交实验,以流速（0.6m L/m i n、0.8m L/m i n、1.0 m L/m i n），波长（210nm、220nm、254nm），柱温（25℃、30℃、40℃），有机相甲醇和水相之比（75∶25、70∶30、85∶15）设计的正交表，经试验的最佳测定条件见表1中8号试验条件。萘的标准溶液的配制,称取0.2142 m g的萘标准品溶于甲醇溶液，配制成5m L体积备用，萘的标准液的浓度为42.84518 μg/m L。

1.7 香菇粗酶液处理雾霾样品

采用L934正交实验，四因素分别是温度（35℃、40℃、30℃），处理时间（10h、20h、30h），pH（4.0、4.4、4.8），加入酶的量（5m L、10m L、15m L）。结果如表2所示。

1.8 雾霾样品中物质的检测

按操作要求打开高效液相仪器，按照波长210nm、柱温30℃、流速1.0m L/m i n、有机相与水相的比为75∶25，待基线平衡后，开始进样。得出数据如表2、表3和图1。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱检测条件参数的确定结果

本实验中作者采用表1雾霾检测条件的4因素3水平正交实验表来找出检测雾霾样品的最适条件，可以看到在序号1条件为最适条件：流速1.0m L/m i n,温度30℃,波长210nm,有机相和水相之间的比为 75∶25。

2.2 不同条件下香菇粗酶液降解雾霾样品的效果

表2 香菇粗酶液处理雾霾样品中萘的4因素3水平正交实验表

由表2可知，降解前雾霾样品中的萘含量为0.217494ng·m-3，在温度35℃,pH值4.0,处理时间10h,加入酶的量5m L的条件下降解，萘含量为2.08 ±2.95(pg·m-3)，降解率达到 99.04% 。

在表2的实验条件下，采用香菇粗酶液降解雾霾样品，然后通过高效液相色谱仪检测降解前后样品中物质含量的变化,可见样品中的所含物质数量发生了变化。表明此试验不但降解了萘，同时还降解了一些其他物质。

并且在试验中作者发现在添加香菇粗酶液后，雾霾样品溶液中有沉淀生成，通过对比发现粗酶液与雾霾样品中物质有反应，所以导致生成沉淀。

在表2中，3号和9号试验条件的降解效果也较好，3号的试验条件萘的降解率达到99.46%；9号的试验条萘的降解率达到99.50%，与1号条件差异不显著（P＞0.05）。

3.讨论

3.1 高效液相色谱检测雾霾样品萘的前提条件

实验中高效液相色谱仪器的稳定对整个实验的准确都十分重要，在进样前的准备工作显得十分重要[8]，一定等到基线完全平衡时在进样，甲醇试剂必须是色谱纯级[9]，并且雾霾样品、水相和甲醇都必须经过超声脱气，来保证实验数据的准确性[10]。高效液相色谱被用来检测生物质燃烧时产生的表面活性物质,配上GC/M S检测非常有用[11]。

3.2 高效液相色谱检测雾霾样品萘的正交试验条件

何艺（2017）用固相萃取－高效液相色谱法测定PM2.5中多环芳烃的条件为柱温为35℃，流速0.5m L/m i n，以水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱[12]。蒲彦利（2016）研究PM2.5中16种多环芳烃的高效液相色谱测定中用At hena PAH s专用柱（4.6 m m×250 m m，5μm），柱温 30℃，流动相为乙腈和超纯水，流速1.2 m L/m i n，进样量10μL[13]。本实验创造性的将正交实验用于高效液相色谱检测条件的优化中，正交实验设计有试验次数少，选择的试验条件水平数较多的优点。

3.3 香菇粗酶液成分及活性

香菇粗酶液中含有锰过氧化酶和漆酶,产酶量受氮营养素影响[14]。酿酒的副产物可作为香菇培养基来生产漆酶和锰过氧化酶[15]。叶汉玲,王传槐（1997）对香菇子实体漆酶进行分离纯化，得到单一组分的漆酶，其摩尔式量为55 000。最适PH为2.6，温度为70℃，Km值为0.142m m ol[16]。本试验中对漆酶的性质未进行研究。

漆酶和锰过氧化物酶不能单独降解木质素，甚至单一漆酶在降解木质素时几乎不起作用,两者在一起能有效地降解木质素。对于木质素,其降解是一个复杂的多种酶体系共同作用的结果，不同实验得到不同的结果是完全可以理解的[1]。

张玉 (2006)发现香菇的静置培养优于振荡培养;最适生长及产酶条件：pH值3.5，20℃，Cu2+浓度为0.4m m ol/L，阿魏酸、愈创木酚、没食子酸、黎芦醇会抑制香菇菌丝生长；Tween-80不利于漆酶合成。以2,2′-连氮-双 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)为底物的最佳反应温度是65℃,pH值为2.2[17]。孙瑞雪（2015）对虎皮香菇漆酶发酵进行优化，漆酶活性达462.59 U/m L，为优化前的26倍[18]。本实验中香菇粗酶液中漆酶的活性为8.0126U/m L，数值较低，未采取优化培养。有研究发现漆酶、碳水化合物清除酶、α-支链淀粉酶和β葡聚糖酶组成的复合体系可以用来促进香菇发酵大豆粉过程中酚类抗氧化剂的形成[19]。

3.4 雾霾中萘的含量分布

李建平（2017）发现天津雾霾中萘的含量为0.12～0.22ng/m3[20]。何艺(2017)测定杭州某小吃街PM 2.5中多环芳烃未检测到萘[12]，王茜(2016)测定唐山市区大气PM2.5中18种PAH s也未检测到萘[21]。常君瑞 (2016)研究北京某地PM2.5中萘浓度为0.02～0.15 ng/m3[22]。江阳(2015)研究成都市不同区域的空气中在11月、12月和1月的雾霾中萘的含量为0.26～2.26 ng/m3[23]。彭希珑（2009）发现冬季广州市越秀区某小学雾霾中萘的平均含量为0.652ng/m3[24]。彭希珑(2009)研究南昌市区雾霾成分,未检出萘[25]。高少鹏（2006）发现北京市某钢铁厂和焦化厂附近空气中16种EPA优控多环芳烃(PAH s)污染情况严重[26]。

4 结论

本实验先使用正交实验设计对高效液相检测条件进行优化，得到最适条件为流速1.0 m L/m i n，温度30℃，波长210nm，甲醇和水相之间的比为75∶25;然后再用正交实验优化香菇粗酶液降解雾霾中萘的条件参数，结果为温度35℃,pH值4.0,处理时间10h,加入酶的量5m L；降解前雾霾中的萘含量为0.217494ng·m-3，降解后萘含量为2.08±2.95(pg·m-3)，降解率达到 99.04% 。

[1]王鼎.香菇漆酶优化培养[D].[武汉]:武汉工程大学,2009.

[2]江凌,吴海珍,韦朝海,等.白腐菌降解木质素酶系的特征及其应用[J].化工进展,2007,26(2):198-203.

[3]池玉杰,伊洪伟.木材白腐菌分解木质素的酶系统-锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶催化分解木质素的机制 [J].菌物学报,2007,26(1):153-160.

[4]李建粮,陈宏义,葛敏俊.雾霾现象及其定义的探讨[C].浙江省台州市:浙江省台州市气象局,2014:1-6.

[5]程春英,尹学博.雾霾之PM_(2.5)的来源、成分、形成及危害[J].大学化学,2014,(5):1-6.

[6]柴静雯，陈玉浩，孙文监，付宝华，邵志良，冯文德.长期萘接触对人体的危害及中毒诊断指标研究[J].卫生研究,1994,23(2):113-115.

[7]柴静雯,陈玉浩,李成昌.职业性慢性萘暴露对人体危害的研究[J].职业与健康,2000,16(4):1-4.

[8]吴少敏,张雅芝,殷博昊.高效液相色谱的使用与维护[J].实验室科学,2011,14(3):183-186.

[9]曾令权.高效液相色谱柱使用心得[J].黑龙江医药,2013,26(1):96.

[10]郑伟,孙东方.高效液相色谱柱的选择、使用与维护[J].口腔护理用品工业,2011,21(6):37-39.

[11]Ahmed M,Guo X,Zhao X.Application of Simple μLtrasonic Assisted Extraction Coupled with Hplc and Gc/ms for the Determination of Surface Active Compounds in Atmospheric ParticμLate Matter[J].Microchemical Journal,2017,130(1):400-411.

[12]何艺,冯涛.固相萃取-高效液相色谱法测定PM2.5中多环芳烃[J].山西化工,2017,167(1):38-40,44.

[13]蒲彦利,张春玲,薛渊,等.PM_(2.5)中16种多环芳烃的高效液相色谱测定法[J].职业与健康,2016,?32(24):3349-3352,3358.

[14]Buswell JA,Cai Y,Chang S.Effect of Nutrient Nitrogen and Manganese on Manganese Peroxidase and Laccase Production By LentinμLa(lentinus)Edodes[J].Fems Microbiology Letters,1995,128(1):81-87.

[15]Hatvani N,Mécs I.Production of Laccase and Manganese Peroxidase By Lentinus Edodes on Malt-containing By-product of the Brewing Process[J].Process Biochemistry,2001,37(5):491-496.

[16]叶汉玲,王传槐,John A.Buswel.新鲜香菇子实体漆酶的纯化与性质[J].南京林业大学学报,1997,21(2):52-55.

[17]张玉,洪枫.优化培养条件对提高香菇漆酶产量的研究[J].林产化学与工业,2006,26(2):74-78.

[18]孙瑞雪,杨萍,刘琦,等.虎皮香菇漆酶的发酵优化[J].食品研究与开发,2015,36(21):156-161.

[19]Mccue P,Horii A,Shetty K.Mobilization of Phenolic Antioxidants From Defatted Soybean Powders By Lentinus Edodes During Solidstate Bioprocessing1 Is Associated with Enhanced Production of Laccase[J].Innovative Food Scienceamp;Emerging Technologies,2004,5(3):385-392.

X172；S828.45

A

1006-4907（2017）05-0038-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.018

周孟清（1976～），男，湖南长沙人，讲师，主要研究方向:饲料资源和添加剂开发，E-mail:zhoumq2005@163.com。

2017-08-10