雷公藤多甙片对狼疮性肾炎外周血单个核细胞多药耐药蛋白表达的影响

张文娟+肖厚勤+苏玉玲

[摘要] 目的 研究雷公藤多甙片（TG）對狼疮性肾炎外周血单个核细胞（PBMCs）多药耐药蛋白表达的影响。方法 选择2015年11月～2017年5月我院收治的58例LN患者为研究对象，分为接受TG治疗的TG组（29例）和接受常规激素治疗的对照组（29例），分别提取两组治疗前后PBMCs，采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测TG对PBMCs多药耐药相关蛋白蛋白（MRP）和多药耐药相关基因（MDR1）和P-糖蛋白170（P-gp 170）表达的影响。结果 治疗3个月后，两组PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达量均明显提高（P<0.05），且TG组PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达量显著高于对照组（P<0.05）；两组PBMCs P-gp 170阳性表达率均明显提高（P<0.05），且TG组PBMCs P-gp 170阳性表达率显著高于对照组（P<0.05）。 结论 TG可有效提高LN患者PBMCs MRP、MDR1及P-gp 170表达，提高患者免疫力，改善预后，LN患者治疗中应检测多药耐药蛋白表达水平以确定其耐药性。

[关键词] 狼疮性肾炎；雷公藤多甙片；单个核细胞；多药耐药蛋白

[中图分类号] R593.342 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）20-45-03

The effect of tripterygium glycosides on the expression of multidrug resistance proteins in peripheral blood mononuclear cells in patients with lupus nephritis

ZHANG Wenjuan XIAO Houqin SU Yuling

Department of Nephrology，Rheumatology and Immunology， the Fifth People's Hospital of Dongguan，Dongguan 523000，China

[Abstract] Objective To study the effect of tripterygium glycosides （TG） on the expression of multidrug resistance proteins in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） of patients with lupus nephritis （LN）. Methods A total of 58 patients with LN treated in our hospital from November 2015 to May 2017 were selected as study subjects and divided into TG group （treated with TG，29 cases） and the control group （given routine hormonotherapy，29 cases）.PBMCs of the two groups were extracted before and after treatment， and reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the effects of TG on the expression of multidrug resistance associated protein （MRP），multidrug resistance associated genes （MDR1） and P-glycoprotein 170 （P-gp 170） in PBMCs. Results After 3 months of treatment，the relative expression levels of PBMCs，MRP and MDR1 mRNA in two groups were significantly increased （P<0.05），and TG group，MDR1 mRNA expression was significantly higher than the control group （P<0.05） the relative expression of PBMCs MRP and MDR1 mRNA in of TG group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）.The positive expression rates of PBMCs P-gp 170 in two groups were significantly increased （P<0.05），and the positive rate of PBMCs P-gp 170 expression in the TG group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. Conclusion TG can effectively improve the expression of PBMCs，MRP，MDR1 and P-gp 170 in patients with LN，improve the immunity of patients and improve the prognosis.The expression level of multidrug resistance protein should be detected in patients with LN in order to determine their drug resistance.endprint

[Key words] Lupus nephritis；Tripterygium glycosides；Mononuclear cells；Multidrug resistance proteins

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是继發于系统性红斑狼疮（SLE）最常见的严重疾病，其发病率高达60%，且存在肾脏病变，严重影响患者的生存率[1]。为阻止LN的进展和复发，保护患者肾功能，临床主要的治疗方法为免疫抑制治疗的糖皮质激素（GC）治疗，但复发率高、费用高，且存在副作用[2]。雷公藤多甙片（tripterygium glycosides，TG）是具有较强抗炎和免疫抑制作用的雷公藤提取物制成的片剂，对LN的疗效较好[3]。本研究选取2015年11月 ～ 2017年5月我院收治的58例LN患者为研究对象，探讨TG对LN患者外周血单个核细胞多药耐药蛋白表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年11月～2017年5月期间我院收治的58例本地区LN患者为研究对象，患者均符合美国风湿协会提出的SLE诊断标准[4]，经B超引导下肾穿刺活检术，常规病理和免疫病理均符合LN病变，均为第一次治疗；经本院伦理委员会同意；患者均签署自愿入组同意书；排除月经不正常的女性、其他肾脏疾病、类风湿性关节炎或严重精神异常者。将58例患者随机分为TG组（29例）和对照组（29例），TG组男/女为1/28，平均年龄（37.59±4.20）岁，平均病程2.4年；对照组男/女为1/28，平均年龄（38.06±4.29）岁，平均病程2.2年，两组LN患者一般资料无统计学意义（P>0.05）。

1.2 治疗方法

所有患者均给予常规激素治疗，TG组加用TG（广东华南药业集团有限公司，Z44023753，10mg），口服20mg/次，3次/d，两组均持续治疗1个月。

1.3 检测方法

1.3.1 RT-PCR法检测治疗前后PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达水平 分别于治疗前和治疗后采集空腹10h外周静脉血2ml，采用梯度离心法分离提取PBMCs，提取RNA后反转录合成cDNA直接进行RT-PCR扩增，扩增条件：94℃预变性5min；MRP：94℃变性50sec，退火54℃50sec，72℃延伸1min，共38个循环，72℃10min，42℃ 5min；MDR1：退火温度为56℃，其他与MRP一样；以β-actin为内参物，引物由上海生物工程技术有限公司合成，见表1。扩增产物均在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，使用凝胶成像分析仪进行光密度扫描，结果采用2-△△CT的方法计算MRP和MDR1的相对表达量。

1.3.2 流式细胞仪检测P-gp 170水平 采集治疗前和治疗后空腹血样标本50μL→加入6μL PE标记的P-gp 170→混匀后，室温避光孵育15min→加入500μL溶血素，溶血10min→加入9g/L盐水1mL混匀→离心5min，弃上清液→加入250μLPBS，混匀→使用Beckman CytoFLEX流式细胞仪测定淋巴细胞和P-gp 170阳性表达率。

1.4 统计学处理

应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达量等计量数据用（）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达水平比较

治疗前，两组PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达量比较，均无统计学意义（t=1.22，0.89，P>0.05）；治疗3个月后，两组PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达量均明显提高（t=8.39，8.77，3.27，4.09，P<0.05），且TG组PBMCs MRP、MDR1 mRNA相对表达量显著高于对照组（t=5.49，3.72，P<0.05）。见表2。

2.2 两组治疗前后PBMCs P-gp 170水平比较

治疗前，两组PBMCs P-gp 170阳性表达率比较，无统计学意义（t=0.22，P>0.05）；治疗3个月后，两组PBMCs P-gp 170阳性表达率均明显提高（t=12.28，3.76，P<0.05），且TG组PBMCs P-gp 170阳性表达率显著高于对照组（t=7.96，P<0.05）。见表3。

3 讨论

大多中医学者认为LN的病机为素体气阴亏虚，肝肾不足，热毒或湿毒乘虚而入，其治疗应以中药为佳，不仅疗效优于单纯西药治疗，还能减轻西药的不良反应和减少病情反复[5]。雷公藤多甙片是近年来被临床证实是治疗LN的佳药，其药物成分为雷公藤根部提取物，而雷公藤是由二萜、生物碱、三萜、甙、糖、醇等多种成份共同发挥抗炎、免疫调节、抗菌等药理作用[6-7]。LN患者治疗失败或病情反复的主要原因为其治疗中的获得性多药耐药，发生的机制较复杂，按照细胞内药物作用靶点的不同，可分为MDR1的过度表达和MRP介导的耐药性等[8]。MDR1基因可编码膜糖蛋白P-gp，P-gp170是其产物之一，它可识别多种化学结构或性质不同的药物，可通过消耗能量将进入细胞内的药物跨膜泵出细胞外，降低细胞内药物浓度，通过降低细胞毒作用而存活，从而产生多药耐药作用[9]。MRP基因是一种人体非P-gp的多药耐药基因[10]。近年研究表明，MDR1、P-gp170及MRP在正常人体中表达具有广泛性、低水平、不均匀等特性，遍布人体各大器官组织，且各器官的表达水平差异较大[11]。

笔者研究发现，LN患者PCMCs均有MDR1、P-gp170及MRP的表达，且治疗后表达量明显高于治疗前，提示MDR1、P-gp170及MRP的表达与激素耐药具有相关性，机体在激素刺激下，MDR1和MRP基因活化，导致PCMCs多药耐药蛋白表达也升高，降低机体对激素的敏感性，继而产生激素耐药[12]。而TG组治疗后MDR1、P-gp170及MRP的表达水平明显高于于治疗前和对照组，因为TG与激素联用具有协同作用，TG能通过cAMP稳定激素受体mRNA，上调其数量，从而增强激素作用[13]。同时TG具有抑制和双向调节LN患者免疫功能的作用，它能通过抑制淋巴细胞活化、T淋巴细胞的表达和诱导活化的T淋巴细胞凋亡，发挥其免疫抑制作用，减轻LN患者肾脏病理改变，还可通过其双向免疫调节作用降低机体对药物刺激的非特异性免疫抵抗[14]。过往研究表明，抗肿瘤药物的MDR1、P-gp170及MRP的表达率明显高于正常人，因为抗肿瘤药物能诱导PCMCs 凋亡，随着药物使用时间的延长，PCMCs MDR1、P-gp170及MRP的表达逐渐上升，P-gp170可与TG结合，将TG从胞内转运至胞外，从而发挥缓解细胞毒作用，同时也降低胞内药物浓度，进一步产生耐药现象[15]。endprint

[参考文献]

[1] 于峰，赵明辉.狼疮性肾炎的治疗策略：依据病理指导临床[J].中国實用内科杂志，2015，35（6）：467-470.

[2] 娄美玉，陈文莉.狼疮性肾炎治疗的研究进展[J].临床肾脏病杂志，2016，16（3）：132-137.

[3] 陈芍，梁朝洋，张杰，等.雷公藤多甙片与甲氨喋呤联合治疗类风湿关节炎的临床疗效及对炎症因子的影响[J].现代生物医学进展，2017，17（4）：713-716.

[4] 郭桂梅，何威逊.系统性红斑狼疮诊断标准及治疗进展[J].中华实用儿科临床杂志，2015，30（13）：978-982.

[5] 胡平新，金思佳，鲁盈.狼疮性肾炎的中医药诊疗进展[J].江苏中医药，2016，48（11）：82-85.

[6] 李治成，刘芳.雷公藤多甙片用于慢性肾炎治疗的效果评价[J].西北国防医学杂志，2016，12（37）：798-800.

[7] 刘伟.雷公藤多甙治疗寻常型银屑病的疗效及对T细胞亚群的影响[J].现代中西医结合杂志，2015，27（24）：2996-2998.

[8] 关天俊.狼疮性肾炎多靶点治疗的疗效优势[J].内科急危重症杂志，2015，21（4）：245-247.

[9] 穆艳飞，王彩虹，罗静，等.系统性红斑狼疮患者P-糖蛋白与淋巴细胞亚群的相关性研究[J].中国药物与临床，2014，5（14）：572-575.

[10] 王新平，韩雷，李德华，等.靶向人多药耐药基因 mrp1特异性小分子干扰 RNA 有效序列筛选[J].现代肿瘤医学，2015，7（23）：881-885.

[11] 孔庆暖，傅兴宁，丁晓燕，等.肺癌患者外周血中MDR-1及MRP基因在化疗前后的表达及意义[J].实用肿瘤学杂志，2015，29（2）：127-132.

[12] 王垚，李秋元，吕杰，等.雷公藤对系统性红斑狼疮治疗作用的研究进展[J].国际免疫学杂志，2016，39（6）：625-628.

[13] 王雷，王煜霞，薛会朝.多药耐药相关蛋白在原发性肝癌患者外周血淋巴细胞及癌组织中的表达[J].新乡医学院学报，2017，34（6）：538-541.

[14] 董佳莉，赵文鹏，罗静，等.P-糖蛋白与系统性红斑狼疮的耐药机制的研究进展[J].中华风湿病学杂志，2016，20（4）：265-268.

[15] 李易明，刘宇琨，刘竞，等.多药耐药相关蛋白在乳腺癌患者外周血单个核细胞中的表达研究[J].河北医药，2015，2（37）：176-179.endprint