荧光PCR技术在ICU抗菌药物使用患者中检测真菌感染的临床意义

刘东育，赵洪伟，马庆庆

（1.贵州航天医院重症医学科；2.中心实验室，贵州 遵义 563000）

荧光PCR技术在ICU抗菌药物使用患者中检测真菌感染的临床意义

刘东育1，赵洪伟1，马庆庆2

（1.贵州航天医院重症医学科；2.中心实验室，贵州 遵义 563000）

目的分析比较聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法与传统培养法在重症加强护理病房（intensive care unit,ICU）抗菌药物使用患者中检测真菌感染的临床意义。方法我院使用多种抗菌药物的患者，取痰液60份，血液30份。将每例标本采集两份，一份真菌培养，另一份冻箱保存，到一定数量后用PCR方法检测真菌。结果在90份临床标本中，二种方法均检测出白色念珠菌、 热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌，以白色念珠菌为多。二种方法对念珠菌所检出率无显著性差异。结论PCR检测疑似菌感染临床标本具有快速简便，稳定性好、敏感性和特异性均较理想的特点，值得临床实验室推广使用。

聚合酶链式反应；假丝酵母菌属；真菌

真菌是医院感染常见的病原菌，传统的培养法时间长、灵敏度低，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法能快速、直接地检测标本中感染的真菌，可以作为早期快速诊断的工具[1,2]。与一般细菌感染患者相比，假丝酵母菌属感染患者的预后较差，因此有必要开发一种迅捷、准确的检测方法[3]。本研究通过比较PCR检测方法与传统培养法的诊断敏感性与准确性，旨在更早鉴定所感染的真菌，指导临床合理用药，提高抗真菌的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 临床标本 收集2013年1月-2017年1月，我院在ICU中使用多种抗菌药物，如：头孢类药物、喹诺酮类药、亚胺培兰-西司他丁钠等或联合用药的90例患者，治疗7天后仍持续发热，临床疑似真菌感染的病例标本：痰液60份，血液30份。90份标本中，男性52例，女性38例；平均年龄65岁；同一标本检测出2种或≥3种菌株时，仅选用优势菌株。

1.2 传统培养及科玛嘉显色鉴定 将临床样本接种于萨布罗培养基（天津市金章科技发展有限公司）中进行培养，涂片镜检为真菌后接种至科玛嘉（郑州博赛生物技术股份有限公司）假丝酵母菌显色培养基（CHROMA-gar）中进行培养，假丝酵母菌属类别根据菌落颜色的变化进行鉴定。白色假丝酵母菌为翠绿色，热带假丝酵母菌为蓝灰色，克柔假丝酵母菌为粉红色，光滑假丝酵母菌为紫色，其他假丝酵母菌为白色（如近平滑假丝酵母菌等）。

1.3 真菌基因提取及PCR扩增 待检标本的真菌DNA用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取。根据假丝酵母菌IST1、ITS2及拓扑异构酶II的序列设计的不同种类的特异性引物，引物均由生工生物工程（上海）有限公司代为合成。以提取的基因组DNA为模板，采用以下试验体系和程序进行PCR扩增，PCR反应体系（终浓度）：1×PCR缓冲液液（含MgCL2），上、下游引物各0.2 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，DNA模板，2.5 U TaqDNA聚合酶，灭菌ddH2O补至50 μL。扩增程序：94oC预变性3 min、94oC变性30 s、58oC退火1 min、72oC延伸1 min，30个循环、72oC延伸10 min。扩增完毕后，将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶（含EB 0.5 μg/mL）中进行电泳，在Bio-Rad凝胶成像分析系统上进行分析、摄相，根据扩增片段大小来判断假丝酵母菌的型别。每次PCR试验整个过程需严格控制污染，均需设置空白对照（模板DNA用ddH2O代替）及阳性对照。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析所得数据，计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 假丝酵母菌属的阳性率及标本来源分布 经传统的萨布罗培养基培养并镜检后，90份疑似真菌感染的标本中真菌感染28份，阳性率为31.11%。见表1。

表1 PCR法与传统真菌培养法检测标本结果

2.2 PCR方法对临床标本的检测 经PCR检测发现，90份标本中阳性31份，阳性率为34.44%，其中白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌分别检出21株、3株、1株。见图1。

图1 真菌基因提取及PCR扩增结果。M：Marker。内控：人固有基因组作为内控。5、6、7、8、10、11、12、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、32：白色念珠菌。1、4、31：热带假丝酵母菌。30：光滑假丝酵母菌。

2.3 PCR与传统培养法的比较 两种方法对念珠菌所检出率无显著性差异，检测一致性较好。

3 讨论

本研究通过两种不同的方法对90份疑似真菌感染标本进行检测发现，PCR法与传统萨布罗培养及科玛嘉假丝酵母菌显色法相比，对念珠菌的检出率无统计学差异，说明检测的一致性较好，但PCR法1个工作日即可出结果，提高了检测效率，缩短检测时间。可见，PCR法具备方便、快速诊断等特点[3]。本研究所收集的疑似标本主要为痰液（其中痰液60份，血液30份），通过对这些感染标本进行PCR法及传统假丝酵母菌数培养法的鉴定发现，最常见的真菌是白色假丝酵母菌，其次为热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌，与以往报道结果一致。

PCR是一种可快速诊断细菌或真菌感染的实验室方法[4]。实验的全过程要严格按照相关要求进行操作，并要求设计相关的空白和阳性对照，以便最大限度地保证试验的准确性。随着大剂量、长时间抗菌药物的使用导致真菌感染的几率加大，患者死亡率增加[5]。PCR检测作为深部真菌感染的诊断方法更为快速、简洁、敏感、准确。

综上，PCR检测疑似菌感染临床标本具有快速简便，稳定性好、敏感性和特异性均较理想的特点，值得临床实验室推广使用。

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