遵义地区慢性乙型病毒性肝炎少数民族患者检测基因分型与耐药变异的相关性和意义

文晓飞，马庆庆，熊玮，余乐兰，唐淑亚

（贵州航天医院感染科，贵州 遵义 563000）

遵义地区慢性乙型病毒性肝炎少数民族患者检测基因分型与耐药变异的相关性和意义

文晓飞，马庆庆，熊玮，余乐兰，唐淑亚

（贵州航天医院感染科，贵州 遵义 563000）

目的研究2015年4月-2017年4月遵义地区苗族、仡佬族慢性乙型肝炎（HBV）患者63例基因分型和耐药基因变异相关性和意义。方法选择63例HBV DNA阳性慢性乙型病毒性肝炎少数民族患者，以拉米夫定为首选治疗药物，以阿德福韦醋和恩替卡韦为耐药患者替代治疗药物；所有患者进行HBV基因分型，并进行耐药变异测定，对其用药情况进行为期2年的追踪分析。结果基因分型：本组病例包括B型43例、C型19例、BC混合型1例。在为期2年的追踪治疗中，共发生耐药变异12例（19.04%），其中B型变异率11.62%，C型变异率36.84%，各基因型之间差异显著（P＜0.05）；治疗1年、2年的耐药变异率随着治疗时间的延长显著升高（P＜0.05）；B型基因YVDD变异为主，占80%，其余 1例为YIDD变异占20%，C型基因均为YIDD变异 。结论慢性乙型病毒性肝炎少数民族患者HBV基因分型和耐药变异具有一定的相关性，建立基因分型、耐药变异、前C区突变检测技术可为乙型病毒性肝炎的临床诊治提供指导性策略。

HBV基因分型；耐药变异；核苷酸类似物

慢性乙型病毒性肝炎，作为全球性关注的公共卫生问题，严重威胁到人类健康。人类感染HBV基因型的类别有可能与疾病的感染谱、疾病的进展、感染途径有一定的联系[1,2]。随着核苷（酸）类药物在HBV治疗的广泛应用，耐药等问题也相继出现[3]，定期检测HBV基因突变对于合理使用核苷酸药物具有重要意义[4]。本研究通过检测HBV基因型与治疗乙型肝炎常用药物的耐药位点做鉴定分析，为抗病毒治疗的疗效评价和用药方案的调整提供依据 。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选择2015年4月-2017年4月贵州航天医院门诊和住院63例慢性乙型病毒性肝炎少数民族患者，HBV-DNA阳性的血清，成功进行基因分型。其中男性52例，女性11例，年龄22岁-65岁，中位值（38.4±11.6）岁。诊断均符合2010年中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分会联合修订的“慢性乙型肝炎防治指南”诊断标准[5]。所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及自身免疫性肝病。

1.2 研究方法

1.2.1 治疗方法 所有患者给予保肝降酶对症支持治疗，在此基础上以拉米夫定（LMV）首选抗病毒药物，并以阿德福韦（ADV）和恩替卡韦（ETV）为耐药患者替代治疗药物。

1.2.2 基因测定方法 HBV基因分型采用PCR和DNA反向点杂交。

1.2.3 DNA提取和PCR扩增 ①DNA提取：采用直接煮沸法，检测HBV-YIDD、YVDD基因突变；②基因扩增：HBV-YIDD、YVDD试剂盒为杭州艾康生物技术公司产品，ABI-7500全自动荧光定量PCR系统为美国Life公司产品。PCR步骤为95oC，180 s，1个循环。94oC，15 s；62oC，30 s，40个循环。

1.3 统计学方法 数据分析应用SPSS 17.0软件，计数资料以百分比（%）表示，采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因分型结果 慢性乙肝病毒肝炎少数民族患者B型43例（68.25%）、C型 19例（30.16%）、BC混合型1例（1.59%），未见其他基因分型。

2.2 基因型与耐药变异检测 在为期2年的追踪治疗中，共发生耐药变异12例（19.04%），其中B型变异率11.62%，C型变异率36.84%，BC型无变异，各基因型之间差异显著（P＜0.05），见表1。

表1 基因型与耐药变异情况

2.3 治疗1年、2年的耐药变异情况 治疗1年、2年的耐药变异率分别为3例（4.7%），9例（14.28%），随着治疗时间的延长显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 治疗1年、2年的耐药变异情况

2.4 基因型与慢性乙型肝炎病毒耐药突变情况 B型基因YVDD变异为主，占80%（4/5），其余1例为YIDD变异占20%（1/5）；C型基因均为YIDD变。其变异类型差异显著（P＜0.05），见表3。

表3 慢性乙肝病毒耐药突变情况

3 讨论

慢性乙型肝炎感染者伴有乙肝病毒活动性复制是发展成为进展性肝病，如肝硬化、肝癌的重要相关因素[6]。HBV基因型及亚型与乙型肝炎的进展及抗病毒疗效均有一定的相关性。在慢性乙肝抗病毒治疗中，核苷（酸）类似物（NUC）作用强效而迅速，不良反应轻，口服给药，患者耐受性好，已被大多数慢性乙肝患者所接受。但在长期治疗过程中均可出现耐药变异YMDD变异，其变异方式与HBV基因型有关。本研究结果显示：主要以 B、C两型为主，B型占明显优势；2年治疗时间中，随着用药时间的延长，变异率逐年升高。其中拉米夫定耐药以YVDD和YIDD突变为主。研究已发现YMDD主型区发生耐药的点突变通常有两种形式。一种为第 741位鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代（G→T），其编码的550位的蛋氨酸变为颉氨酸（YMDD→YVDD）。YIDD和YVDD变异所诱导的HBV耐药的机理是HBV DNA聚合酶基因发生突变,导致与拉米夫定的结合力降低。虽然本次耐药变异所占的比例较小，未发现阿德福韦酯和恩替卡韦耐药，但对于即将进行抗病毒治疗或者治疗后无作用的患者，有必要检测HBV耐药变异情况，并及时调整治疗方案实现个体化治疗。

综上所述，乙肝病毒肝炎患者基因分型和耐药变异具有一定的相关性，值得进一步研究其他核苷（酸）类似物的耐药突变情况，为临床提供更加有效的治疗案。

[1]Yatsuji H,Noguchi C,Hiraga N,et al.Emergence of anovel Lamivudine-resistant hepatitis Bvirus variant with a substitution outside the YMDD motif [J].Antimicrob Agents Chcomther,2014,50(8): 3867-3874.

[2]朱中梁,汪宏良,马娟.乙型肝炎病毒基因分型及耐药突变基因检测研究[J].中国基层医药,2013,20(8): 1203-1205.

[3]Griffiths PD.A perspective on antiviral resistance [J].J Clin Virol,2009,46(1): 3-8.

[4]向华国,杨晓丽,蒲荣,等.拉米夫定联合阿德福韦酯治疗前后乙型肝炎病毒的全基因组序列分.中国微生态学杂志,2012,24(1):40-42。

[5]中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志,2005,13(12): 881-891。

[6]Valsamakis A1.Molecular testing in the diagnosis and management of chronic hepatitis B [J].Clin Microbiol Rev,2007,20(3): 426-439.