HSF1对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用及其相关差异表达基因的筛选*

肖 归， 王桂良， 陈广文， 王小莉， 张华莉， 王慷慨， 刘梅冬， 刘 可， 肖献忠△

(1中南大学湘雅医学院病理生理学系， 湖南 长沙 410008； 2海南医学院国际护理学院， 海南 海口 571199； 3赣南医学院附属萍乡医院消化内科， 江西 萍乡 337000)

·短篇论著·

HSF1对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用及其相关差异表达基因的筛选*

肖 归1,2， 王桂良3△， 陈广文1， 王小莉1， 张华莉1， 王慷慨1， 刘梅冬1， 刘 可1， 肖献忠1△

(1中南大学湘雅医学院病理生理学系， 湖南 长沙 410008；2海南医学院国际护理学院， 海南 海口 571199；3赣南医学院附属萍乡医院消化内科， 江西 萍乡 337000)

目的探讨热休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)减轻脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠急性肺损伤的作用及其分子机制。方法采用气管滴注LPS的方法制备小鼠急性肺损伤模型，观察HSF1野生型小鼠(HSF1+/+)和HSF1敲除小鼠(HSF1-/-)肺大体改变和肺组织病理改变,检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中总蛋白、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6的蛋白表达。 采用基因芯片技术筛选经LPS处理后的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织中的差异表达基因，并进一步采用real-time PCR对CXC趋化因子受体2(CXC chemokine receptor 2，CXCR2)的表达进行验证。结果与经LPS刺激后的HSF1+/+小鼠相比，经LPS刺激的HSF1-/-小鼠肺大体和病理损伤加重，BALF中总蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。 基因芯片分析发现，与经LPS处理的HSF1+/+小鼠相比，HSF1-/-小鼠共筛选出918个差异基因，有65个基因表达差异明显，其中Atg7、ccr1、cxcr2、Tbl1xr1、Mmp9、Pparg、Plcb2、Arrb2、Cntn1、Col4a6等共 28个基因在HSF1-/-小鼠的肺组织中表达明显上调；Fgfr1、Fgfr2、Map4k4、Ddx58、Tfg、Stat3、Smad4、Lamc1、Sdc3等共37个基因表达明显下调。 Real-time PCR结果显示，CXCR2的mRNA水平在LPS刺激的HSF1-/-小鼠肺组织较HSF1+/+小鼠表达明显上调，表达趋势与基因芯片结果一致。结论HSF1能减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤，CXCR2可能参与了对肺组织的保护作用。

急性肺损伤； 热休克因子1； 基因芯片； 差异基因表达

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)指由各种非心源性因素造成肺部炎症和通透性增加的综合征，主要表现为肺毛细血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞损伤和急性进行性缺氧性呼吸衰竭[1]，主要病因为感染、胶原血管疾病、药物摄入、吸入有害物质、休克、急性嗜酸性肺炎、免疫介导的肺出血和血管炎及放射性肺炎等。ALI发病率和病死率极高且各种治疗方法效果不理想，因此在临床治疗和基础研究中都引起了高度的重视[2-3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分，采用气管滴注LPS的方式可用来制备ALI模型[4]。

当生物体遭受感染、毒物、高温、自由基等应激原作用时，机体会出现热休克反应(heat shock response，HSR)[5]。HSR受转录因子家族精细调控，热休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)是其中最重要的转录因子。本科室在前期研究中也发现，HSF1-/-小鼠对LPS的敏感性显著增强，HSF1对LPS所致的内毒素血症具有明显的抑制作用[6]，但是HSF1对ALI是否具有抑制作用以及具体机制目前尚不明确。

基因芯片可通过探针分子与样品分子杂交，检测杂交信号的强弱从而获得样品分子的数量和序列信息，具有高效率和便捷的优点[7]。本研究以HSF1+/+小鼠和HSF1-/-小鼠为研究动物，经气管滴注LPS制备ALI模型，分析HSF1对ALI的保护作用，并采用基因芯片技术筛选HSF1+/+小鼠和HSF1-/-小鼠ALI模型中肺组织基因表达谱的差异，探索HSF1在LPS诱导的ALI中起保护作用的潜在分子机制。

材 料 和 方 法

1动物

SPF级HSF1-/-和HSF1+/+小鼠，由美国德克萨斯大学西南研究中心Ivor J. Benjamin惠赠，喂养在中南大学湘雅医学院实验动物中心，由专人负责小鼠基因型检测，获取雄性HSF1-/-和HSF1+/+小鼠，2～3月龄，25 g左右。将小鼠分为HSF1+/++生理盐水(NS)组、HSF1+/++LPS组、HSF1-/-+NS组以及HSF1-/-+LPS组，其中，HSF1+/++LPS组和HSF1-/-+LPS组按照5 mg/kg的剂量从气管滴注LPS(浓度0.8 g/L)，而HSF1+/++NS组和HSF1-/-+NS组从气管滴注同等体积的NS。

2主要试剂

LPS购于Sigma；BCA蛋白定量试剂盒和4%多聚甲醛购于北京鼎国生物公司；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α， TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6的ELISA试剂盒购买自欣博盛生物科技公司；Trizol试剂购于Invitrogen；PCR反转录试剂盒以及Taq聚合酶均购自TaKaRa；GeneChip® Mouse Transcriptome Assay 1.0为Affymetrix产品(含23 000个基因)。

3主要方法

3.1小鼠急性肺损伤模型的建立 用1.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，暴露小鼠气管后，用1 mL注射器缓慢滴加LPS(5 mg/kg, 浓度为0.8 g/L)入气管内，竖立起小鼠，旋转，使LPS分布均匀，对照组给予NS气管内滴注。

3.2观察小鼠肺大体变化情况 造模6 h后处死小鼠，取出肺组织，用滤纸吸去表面血渍，肉眼观察不同组小鼠肺组织的大小、颜色、形状等指标。

3.3小鼠肺组织病理变化的观察 小鼠肺组织取材后，使用4%多聚甲醛固定24 h，经石蜡包埋后做成10 μm切片，切片使用二甲苯脱蜡后，经各级乙醇至水洗环节，HE染色5～15 min，常规清洗、脱水、封片，置于光学显微镜观察肺部组织学改变，显微镜下随机选择3～5个视野，于200倍和400倍拍照，不同染色相同视野采用Adobe Photoshop CS6软件叠加合成。

3.4ELISA法测定小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中细胞因子的含量 暴露小鼠气管，用1 mL注射器抽1 mL PBS缓慢注入支气管，用手指轻轻振荡小鼠胸廓1 min，然后回抽液体，保存在EP管中，1 500 r/min离心5 min，上清用于BCA蛋白定量和VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量检测。

3.5肺组织 RNA 的提取 用Trizol试剂抽提小鼠肺组织的总RNA，用DNA酶消化除去总RNA中的DNA， 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，紫外分光光度计测量A260/A280比值。

3.6基因芯片检测 在PCR管配制总RNA变性反应体系，变性反应结束后配制cDNA第一链合成反应体系，体系内含Cy3/Cy5荧光标记。取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，混合于PCR管内，加入杂交缓冲液和甲酰胺。将杂交芯片水平放入加有PBS的杂交盒，置42 ℃杂交箱中避光杂交，结束后，将芯片盒用Affymetrix 扫描仪扫描获取图像并导入图像分析软件，采用 GeneChip Scanner 3000 对芯片结果进行扫描，用 Command Console Softeware 4.0 读取原始数据，采用 Expression Console对合格数据进行归一化处理。使用GeneSpring和Cluster分析软件进行聚类分析，用Pathway进行基因信号通路分析。

3.7Real-time PCR的验证 采用Real-time PCR的方法对在HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织中表达有差异的关键基因CXCR2进一步验证。检测基因引物序列由金斯瑞公司设计合成，CXCR2上游引物为5’-TCTGCCACAAAAGCGTCTA-3’，下游引物为5’-GAGTGGCATGGGTTAGTTGG-3’；以β-actin 作为内参照，上游引物为5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物为5’-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3’。配制20 μL的反应体系:上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，SYBR Enzyme 10 μL，cDNA 1 μL，无酶水8 μL。反应条件为： 95 ℃预变性10 min， 95 ℃变性30 s， 60 ℃延伸1 min，40 个循环。

4统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两组样本之间比较选用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1HSF1减轻LPS诱导的ALI小鼠肺大体损伤

未经LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中，肺大体标本无明显损害，经LPS刺激后，HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺体积变大，水肿明显，且颜色明显变黑，HSF1-/-组的肺组织病变损伤程度明显重于HSF1+/+组，见图1。

2HSF1减轻LPS诱导的ALI小鼠肺组织病理学损伤

Figure 1. Macroscopic changes of the lung tissue ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with ALI induced by LPS. A:HSF1+/++NS group; B:HSF1+/++LPS group; C:HSF1-/-+NS group; D:HSF1-/-+LPS group.

图1LPS诱导的急性肺损伤HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠肺大体标本观察

未经LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中，肺组织切片均未见明显异常，经LPS刺激后，HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺泡壁毛细血管充血明显，细支气管腔内存在大量脱落炎性细胞及渗出物，肺泡腔及间质内可见大量红细胞和多形核白细胞浸润，并伴有血栓形成，HSF1-/-组小鼠较HSF1+/+小鼠肺组织的损伤明显加重，见图2。

Figure 2. Pathological changes of the lung tissue ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with ALI induced by LPS (HE staining, ×40). A:HSF1+/++NS group; B:HSF1+/++LPS group; C:HSF1-/-+NS group; D:HSF1-/-+LPS group.

图2LPS诱导的急性肺损伤HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠肺组织病理观察

3HSF1降低LPS诱导的ALI小鼠BALF中蛋白总量和VEGF浓度

未经LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中，肺组织中总蛋白和VEGF表达均较低，差异无统计学显著性；经LPS刺激后，HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织中总蛋白和VEGF表达均显著升高，HSF1-/-组比与HSF1+/+组更高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 3. The changes of the concentrations of total protein and VEGF in BALF ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with ALI induced by LPS. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsHSF1+/++NS group;△△P<0.01vsHSF1-/-+ NS group.*P<0.05,**P<0.01vsHSF1+/++LPS group.

图3LPS诱导的急性肺损伤HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠BALF中总蛋白和VEGF浓度的变化

4HSF1降低LPS诱导的ALI小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度

ELISA结果显示，未经LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达均较低，差异无统计学显著性；经LPS刺激后，HSF1+/+和HSF1-/-小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的蛋白表达均显著升高，HSF1-/-组比与HSF1+/+组更高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

Figure 4. The concentrations of inflammatory factors in the BALF ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with LPS-induced ALI. Mean±SD.n=6.#P<0.05,##P<0.01vsHSF1+/++NS group;△P<0.05,△△P<0.01vsHSF1-/-+NS group；*P<0.05,**P<0.01vsHSF1+/++LPS group.

图4LPS诱导的急性肺损伤HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠BALF中炎症因子浓度的变化

5芯片结果的聚类分析

基因进行聚类分析显示发现：与HSF1+/+小鼠相比，HSF1-/-小鼠一共筛选到918个差异基因，其中有188个基因表达下调，730个基因表达上调。

6芯片结果的信号通路分析

与HSF1+/+小鼠相比，HSF1-/-小鼠肺组织中65个信号通路相关基因表达具有显著差异，有28个基因表达水平上调，有37个基因表达水平下调。GO 信息分析显示上述差异基因主要与代谢调控、应激反应、炎症因子分泌调控、趋化因子调控、蛋白修饰、自身免疫性疾病等密切相关。

7Real-timePCR验证实验结果

研究证明，CXCR2与ALI密切相关，因此我们选定CXCR2来进行验证。结果显示，未经LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织中CXCR2的mRNA表达均较低，差异无统计学显著性；经LPS刺激后，HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织CXCR2的mRNA表达均显著升高，HSF1-/-组比与HSF1+/+组更高，差异具有统计学意义(P<0.05)，变化趋势与基因芯片结果一致，见图5。

Figure 5. The mRNA level of CXCR2 in the lung tissue ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with LPS-induced ALI. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsHSF1+/++NS group;△△P<0.01vsHSF1-/-+NS group；*P<0.05vsHSF1+/++LPS group.

图5LPS诱导的急性肺损伤HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠肺组织中CXCR2的mRNA表达

讨 论

ALI的临床表现主要为进行性呼吸窘迫综合征和低氧血症，它发病机制非常复杂，炎症反应是其重要的机制之一[8-9]。众多研究证明，ALI的严重程度与中性粒细胞和巨噬细胞活化的程度以及迁移到肺泡的数目密切相关，活化的中性粒细胞和巨噬细胞能够产生许多细胞毒性物质，包括颗粒酶、活性氧、活性脂、各种促炎细胞因子和中性粒细胞胞外陷阱，它们通过网织形成陷阱捕获细胞外的病原体，这对于ALI发展至关重要[10-12]。

众多研究证明，HSF1是必不可少的热休克基因，HSF1-/-动物的细胞在遭受高温等刺激时，相比于野生型动物更容易凋亡，这证明了HSF1能够提高细胞的存活率[13]。HSF1能够提高存活率这一现象在很多动物中也有证实。本科室在前期研究中也发现，HSF1-/-小鼠对LPS的敏感性显著增强，并且其生存率显著降低，且HSF1能够有效减少内毒素血症中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达水平，这些结果表明，HSF1对LPS所导致的内毒素血症具有明显的抑制作用[14-15]。但是HSF1对ALI小鼠是否具有保护作用以及具体机制目前尚不明确。本研究结果显示, 未经LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中, 肺组织的大体标本和病理无明显异常，肺组织中总蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达均较低且无统计学差异；经LPS刺激后，HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织的大体标本和病理标本出现损伤、肺组织中总蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的蛋白表达均显著升高；HSF1-/-+LPS组与HSF1+/++LPS组小鼠相比，肺组织的损伤更重，肺组织中总蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的蛋白进一步升高，以上结果表明LPS能诱导小鼠ALI，在非刺激的状态下，HSF1对HSF1肺组织中总蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的表达不起调节作用，经LPS刺激后，HSF1能减轻LPS所致的ALI小鼠血管通透程度，抑制肺组织中总蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的表达从而减轻肺部的损伤情况。

为了进一步了解HSF1对ALI的炎症相关基因的调控，本研究采用基因芯片技术，筛选出了LPS刺激的HSF1-/-小鼠中918个差异基因，其中Atg7、ccr1、cxcr2、Tbl1xr1、Mmp9、Pparg、Plcb2、Arrb2、Cntn1、Col4a6等共 28个基因明显上调，Fgfr1、Fgfr2、Map4k4、Ddx58、Tfg、Stat3、Smad4、Lamc1、Sdc3等共37个基因明显下调，这些表达差异明显的基因主要与代谢调控应激反应、细胞因子分泌、炎症应答、趋化蛋白调控、自身免疫反应等分子生物学过程相关。通过查阅文献[16-17]，我们最终选定CXCR2来鉴定。CXCR2是趋化中性粒细胞的主要趋化因子受体之一，主要通过和IL-8(CXCL8)等趋化因子结合后产生效应，其主要功能是能够趋化中性粒细胞等炎症细胞到损伤部位，参与机体的防御反应或者中性粒细胞的大量增加从而产生更为广泛的组织损伤。CXCR2是一个与ALI密切相关的基因，但目前尚无文献报道HSF1与 CXCR2 在调控 LPS诱导的ALI中的作用。本研究通过基因芯片技术和 real-time PCR结果显示未经LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织中CXCR2 mRNA表达均较低且无统计学差异；经LPS刺激后，HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺组织CXCR2 mRNA表达均显著升高，HSF1-/-组比与HSF1+/+组更高，说明HSF1对 LPS 诱导的ALI炎症保护机制可能是通过下调CXCR2的表达实现的，但HSF1是否通过与CXCR2的启动子区直接结合而调控其表达，是否和其它转录因子协同调控其表达等问题，尚需进一步研究。

总之，本研究证明了HSF1对LPS诱导的急性肺损伤小鼠具有保护作用， CXCR2可能参与了对肺组织的保护作用，这对进一步揭示 ALI/ARDS 的潜在防治靶点有着重要意义。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Protective effect of HSF1 on mice with LPS-induced acute lung injury and screening of relevant differentially-expressed genes

XIAO Gui1, 2, WANG Gui-liang3, CHEN Guang-wen1, WANG Xiao-li1, ZHANG Hua-li1, WANG Kang-kai1, LIU Mei-dong1, LIU Ke1, XIAO Xian-zhong1

(1DepartmentofPathophysiology,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China;2DepartmentofInternationalSchoolofNursing,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China;3DigestionDepartmentofGannanMedicalUniversityPingxiangHospital,Pingxiang337000,China.E-mail:xiaoxianzhongcsu@163.com;gui-liangwang@126.com)

AIM: To study the protective effect of heat shock factor1 (HSF1) on the mice with lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI)， and to screen the relevant differentially-expressed genes.METHODSALI mouse model was established by LPS intracheal instillation. The macroscopic and pathological changes of the lung tissue were observed， and the concentrations of total protein, TNF-α, IL-β, IL-6 and VEGF in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were analyzed. Differentially-expressed genes in the lung tissues ofHSF1+/+mice andHSF1-/-mice with ALI induced by LPS were screened by gene chips. The key gene was verified by real-time qPCR.RESULTSThe macroscopic and pathological changes of the lung injury inHSF1-/-+LPS mice were more serious than those inHSF1+/++LPS mice. The concentrations of total protein, VEGF, TNF-α, IL-1β and IL-6 in the BALF ofHSF1-/-+LPS mice were significantly higher than those ofHSF1+/++LPS mice (P<0.05). Compared with theHSF1+/+mice, a total of 918 differentially-expressed genes were indentified in theHSF1-/-mice, among which the expression levels of 65 genes had obvious diffe-rence， with 28 genes up-regulated, includingAtg7,ccr1,cxcr2,Tbl1xr1,Mmp9,Pparg,Plcb2,Arrb2,Cntn1,Col4a6, etc, and 37 genes down-regulated, includingFgfr1,Fgfr2,Map4k4,Ddx58,Tfg,Stat3,Smad4,Lamc1,Sdc3, etc. The results of real-time qPCR showed that the mRNA level of CXCR2 inHSF1-/-+ LPS mice was significantly higher than that inHSF1+/++ LPS mice, which was consistent with the results of gene chips.CONCLUSIONHSF1 has protective effect on the mice with LPS-induced ALI. CXCR2 may be involved in the protective effect of HSF1 on this process.

Acute lung injury; Heat shock factor 1; Gene chips; Differential gene expression

1000- 4718(2017)11- 2073- 06

2017- 04- 17

2017- 06- 20

国家自然科学基金资助项目(No. 81360080;No. 81671895)

△通讯作者 肖献忠 Tel: 13873102115; E-mail: xiaoxianzhongcsu@163.com； 王桂良 Tel： 15879456496； E-mail: guiliangwang@126.com

R363； R563

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.024