不同电压脉冲射频对慢性坐骨神经压迫损伤大鼠模型下丘脑β-内啡肽的影响

姬高亮 薛朝霞 耿宝梁 刘 旺

（1山西医科大学麻醉学系，太原030001；2山西医科大学第一医院疼痛科，太原030001；3辽宁中医药大学附属第四医院疼痛科，沈阳110100）

不同电压脉冲射频对慢性坐骨神经压迫损伤大鼠模型下丘脑β-内啡肽的影响

姬高亮1薛朝霞2Δ耿宝梁3刘 旺1

（1山西医科大学麻醉学系，太原030001；2山西医科大学第一医院疼痛科，太原030001；3辽宁中医药大学附属第四医院疼痛科，沈阳110100）

目的：观察不同电压脉冲射频(pulsed radiofrequency, PRF)对慢性坐骨神经压迫损伤 (chronic constriction injury, CCI) 大鼠模型下丘脑β-内啡肽含量的影响，探讨脉冲射频的镇痛机制。方法：雄性SD大鼠72只建立CCI疼痛模型后，随机分为4组(n=18)：假刺激组H0、PRF低电压组H1 (45 V)、PRF中电压组H2 (55 V)，PRF高电压组H3 (65 V)。PRF组：制模后7 d对其坐骨神经结扎近端行PRF，脉宽20 ms，频率500 kHz，脉冲频率2 Hz，持续时间2 min，治疗电压分别为45 V、55 V、65 V。假刺激组：制模后7 d在相同位置放置射频电极，但无脉冲治疗，持续时间2 min。制模前、制模后7 d、PRF后1、7和14 d测定大鼠疼痛行为学变化。PRF后1、7和14 d，每组各处死6只大鼠，测定不同时间点大鼠下丘脑中β-内啡肽表达量。结果：脉冲射频组在治疗后1天、7天和14天，与假刺激组比较，热痛阈均明显提高(P＜ 0.01)。其中术后第7日，中、高电压组明显高于低电压组，差异具有统计学意义(P＜ 0.01)；在实验结束时，与假刺激组大鼠比较，术后第1天，7天和14天，低、中、高电压组大鼠下丘脑β-内啡肽含量明显升高(P＜ 0.01)；术后第7、14天，与低电压组相比，中、高组大鼠下丘脑β-内啡肽含量明显升高(P＜ 0.01)；术后第14日，高电压组与中电压组相比，存在显著差异(P＜ 0.01)。结论：电压45 V、55 V、65 V的2 Hz脉冲射频均可引起CCI大鼠热痛阈的升高，可能与其增加下丘脑β-内啡肽的含量有关；脉冲射频电压大于55 V时，治疗效果没有进一步改善。

脉冲射频；不同电压；CCI大鼠；神经病理性疼痛；β-内啡肽

神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP)是由外伤、炎症或其他疾病等引起神经损伤或病变所致的慢性疼痛。其病理生理学特点是痛觉的反应性增高,主要表现为痛觉过敏(hyperalgesia)和痛觉超敏(allodynia)，发病机制复杂，主要包括中枢敏化和中枢去抑制[1]。

慢性坐骨神经压迫损伤模型(chronic const-riction injury, CCI)是研究NPP的经典模型，1988年由Bennett[2]等建立。该模型与临床神经病理性痛特征有相似之处，被广泛用于神经病理性疼痛的研究。目前，国内外关于动物实验的研究发现脉冲射频(pulsed radiofrequency, PRF)有确切的疗效。Laboureyras[3]等将42℃、2 Hz、输出电压45 V、持续2 min的PRF作用于CCI模型大鼠的背根神经节后发现PRF可显著降低大鼠痛觉过敏。Aksu[4]等在兔坐骨神经结扎模型中发现经外周神经的PRF也可有效缓解神经病理性疼痛。马芸[5]等人也发现PRF作用于CCI大鼠后明显提高机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。近年来，国内外研究显示某些离子通道表达、小胶质细胞的活化及相关细胞因子的上调等可能与神经病理性疼痛有关[6,7]。其中，内源性阿片肽系统作为PRF治疗的可能性机制之一，主要通过脊髓、脊髓上和外周三种机制调控外周痛觉信息向中枢传递。β-内啡肽在20 世纪70 年代被发现，主要来自于垂体和下丘脑内侧基底部的阿黑皮素原(proopiomelanocortin, POMC)，是体内具有吗啡样活性的且主要的内阿片肽之一，是对疼痛通路进行调节的主要抑制性递质[8]。内啡肽可抑制痛觉传导递质P物质的释放，可能与其阳性神经元的投射有关，从弓状核发出投射到脑干中与伤害性刺激传递及镇痛有关的核团从而发挥镇痛作用[9]。

脉冲射频(PRF)作为一种新型的疼痛治疗手段，因其创伤小、并发症少且作用显著的特点[10]，在国内外被广泛用于神经病理性疼痛的治疗。1997年Sluijter提出[11]脉冲射频的标准参数为“42℃、2 Hz、2 min”。此参数虽不会带来严重术后并发症，但其疗效和有效维持时间并不理想[12,13]，在临床使用中需要间断多次进行重复治疗，往往给患者带来了很大的心理压力及经济负担。

因此，如何在脉冲射频可逆性损伤的范围内，通过调整不同的脉冲射频参数来提高疼痛治疗的有效率，延长治疗时限？本实验采用随机对照实验设计，在大鼠CCI疼痛模型的基础上，通过调整电压的参数设置行PRF处理后，测量不同时间点大鼠行为学改变以及下丘脑中β-内啡肽的变化，根据检测指标找到最适电压，探讨脉冲射频治疗神经病理性疼痛相关机制，为临床治疗提供科学依据。

方 法

1.模型制备

72只健康雄性SD大鼠(北京动物实验中心提供)，6周龄，SPF级，体重200～220 g，动物饲养室有良好的通风和空气过滤系统，室温维持在25℃左右，湿度55%左右，昼／夜循环，自由摄食水。大鼠用6% 水合氯醛(每100 g注射35 mg)麻醉后，俯卧位固定于操作台上，备皮、消毒后从右侧大腿中部股骨外缘凹陷处切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经主干。用4-0丝线在坐骨神经干中部结扎4个线结，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动而不影响神经外膜的血液流动为宜。每个线结之间间隔约1 mm，术后用医用非吸收性外科尼龙缝合线缝合皮肤切口并消毒。

2.实验分组

将72只大鼠按随机数字表法分为四组（n=18），分别为假刺激组H0、PRF组H1（45 V），H2（55 V），H3（65 V）。PRF组：制模后7天，使用疼痛射频治疗系统（北琪R-2000B D2）对坐骨神经结扎近端(距线结5 mm处)行脉冲射频干预：脉宽20 ms、频率500 kHz，脉冲频率2 Hz，持续时间2 min，脉冲电压分别为45 V、55 V、65 V。假刺激组：制模后7 d，仅在相同位置放置射频电极，无脉冲射频治疗，持续时间2 min。分别于脉冲射频后1、7、14 d，每组各处死6只大鼠，通过酶联免疫法，观察各组大鼠下丘脑β-内啡肽的表达情况。

3. 热痛阈行为学观察

在制模前、制模后7 d，脉冲射频治疗后1、7和14 d (D1、D7、D14)进行行为学测定。所有测定均在固定时间 (9:00～11:00，AM) 和安静环境下进行。按照Hargreaves报道[14]的检测方法，使用热刺激仪（PL-200，泰盟科技）测定大鼠的热痛阈(paw thermal withdrawal latency, PWTL)，调整测痛仪的热刺激强度，使正常热痛阈在8～10 s之间。大鼠被置于单独的透明有机玻璃容器中，预适应30 min，采用测痛仪对大鼠右侧足底中部进行照射，记录热刺激缩足反射时间。每只大鼠每次测量3次，每次间隔5 min。单次照射不超过30 s，以免损伤照射部位。

4. 酶联免疫法检测下丘脑β-内啡肽

取脑：大鼠断头后，迅速取出脑组织，放于冰块上，剥离下丘脑，滤纸擦拭干净，放电子天平称重，然后将组织放入封闭好的EP 管中，投入液氮中冷却。将组织放入匀浆管中，用移液枪按1:9 的比例加入生理盐水，进行匀浆。将匀浆液放入EP管中，放入离心机中，以3000 r/min 离心15 min，取上清，放入-70℃冰箱中待测下丘脑中的β-EP含量。

5. 统计学处理

使用SPSS 17.0统计软件处理数据进行分析。计量资料用均数±标准误(±SEM)表示；对PWTL，组间比较采用方差分析，组内不同时间比较采用独立样本的t检验、LSD、SNK检验；对β-内啡肽含量，采用双因素方差分析；P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

假刺激组（H0）与脉冲射频组大鼠在造模7天后一般情况良好，均未出现足部发红，发热，蜷缩，自噬等症状，分别进行热痛阈检测，与造模前比较发现热痛阈（PWTL）明显降低(P＜ 0.01)，造模成功。各组大鼠不同时间的痛阈值(PWTL)及下丘脑β-内啡肽检测结果均符合正态性及方差齐。在行不同电压的脉冲射频治疗过程中，射频针尖温度在36～38℃之间波动。

1.热痛阈检测结果

脉冲射频组在治疗后1天、7天和14天，与假手术比较，痛阈均明显提高，差异有统计学意义(P＜0.01)。其中术后第1日和14日，低、中、高电压组间无差别；第7日，中、高电压组明显高于低电压组，差异具有统计学意义(P＜ 0.01, 见图1)。

2.下丘脑β-内啡肽检测结果

与假刺激组大鼠比较，术后第1天，7天和14天，低中高电压组大鼠下丘脑β-内啡肽含量明显升高(P＜ 0.01)；术后第7、14天，与低电压组相比，中高组大鼠下丘脑β-内啡肽含量明显升高(P＜ 0.01)；术后第14日，高电压组与中电压组相比，存在显著差异(P＜ 0.05，见图2)。

讨 论

随着人口老龄化，慢性疼痛患者数量逐年增多，对疼痛治疗需求不断提高。脉冲射频是一种神经调节而非神经破坏作用[15]，不产生任何神经组织的长期损伤，并可能促进神经修复，是名副其实的“治病”方式，这一特点符合当前神经病理性疼痛的治疗理念。为了增强疗效，国内外众多学者在临床和实验中进行过部分脉冲射频参数改良的研究，但一直没有突破性进展。Lin[16]等通过动物实验比较不同波形的PRF对NPP的疗效，发现两种波形均有效缓解症状，正弦波效果更明显。卢振和[17]在不同频率脉冲射频对大鼠脊髓背角C-纤维诱发电位长时程增强的影响中，发现2Hz时抑制最优，可能是PRF发挥镇痛效应机制之一。吴大胜[12]成功将手动调整脉冲参数用于临床，近期疗效明显，但未研究高电压时感觉神经是否损伤，并且缺少远期观察。Kim等对PHN患者进行选择性背根神经节脉冲射频术，减少了药物的使用剂量，但效果并不理想[13]。Sluijter[11]认为脉冲射频引起临床疼痛减轻是由于电场作用，但未见不同电压下进行实验的相关报道。生理机制方面，Hamann[18]等发现脉冲射频作用于脊髓背根神经节可导致转录激活因子(activating transcription factor 3, ATF-3)表达上调，而在坐骨神经中不会出现此现象，这可能与组织或细胞的种类有关。武百山[19]发现脉冲射频能明显升高大鼠下丘脑β-内啡肽水平。刘益鸣[6]等人从蛋白表达水平说明超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated cation channels, HCN)可能参与PRF的神经调制过程缓解神经病理痛。Vallejo[7]等人研究发现，PRF可能是通过逆转c-fos的表达下调发挥作用，其中c-fos是疼痛通路神经元活动的一种间接标志物。李多依[20]等对CCI大鼠结扎侧坐骨神经干进行PRF治疗后发现可能是通过修复受损的神经起作用的。

图1 CCI 模型大鼠热痛阈值的比较( ±SEM )**P ＜ 0.01, 与H0 组相比; ΔΔP ＜ 0.01, 与H1 组相比Fig.1 The comparison of PWTL in CCI model rats ( ±SEM )**P ＜ 0.01, compared with group H0; ΔΔP ＜ 0.01, compared with group H1

目前研究显示，PRF治疗外周神经病理性疼痛动物模型及临床效果明显，但国内外对PRF的参数设置尚无标准，温度、脉宽、电压、持续时间等都可能影响到疗效。

本次实验结果显示，假刺激组与脉冲射频组在脉冲射频治疗前各组动物的PWTL比较无差别，具有可比性。经过治疗后，脉冲射频组PWTL均高于假刺激组；术后第1、14天，脉冲射频组间无明显差别；在术后第7天时，中、高电压组PWTL明显高于低电压组，但均低于模型前的PWTL。从分子水平看，脉冲射频组大鼠下丘脑β-内啡肽含量均高于假刺激组，至术后第7、14日，中、高电压组大鼠的β-内啡肽明显升高。术后第14日时，高电压组与中电压组相比差异显著，提示同一时间点相对较高的电压可以维持术后更高浓度的β-内啡肽含量。结合二者，至术后第7日，明显发现提高脉冲射频电压时，β-内啡肽浓度及热痛阈值均有明显升高，提示升高电压所引起的体内β-内啡肽含量的升高可能是脉冲射频缓解疼痛的机制之一；术后第14日，不同的电压导致各组大鼠出现不同浓度的β-内啡肽，而热痛阈值没有明显差异，可能提示当β-内啡肽含量升高到一定值时并不能引起行为学上的改变，但是相对高浓度的β-内啡肽可能会延长脉冲射频的疗效。在整个脉冲射频治疗过程中，监测到射频针尖的温度在36～38℃之间波动，排除了温度的热效应因素及高温对神经造成不可逆损伤。结合临床上“标准参数”的脉冲射频治疗时，监测到针尖温度在达到预设值前，治疗电压出现一过性迅速升高然后下降的变化。这进一步提示，脉冲射频的镇痛作用可能是在电压的场强效应作用下引起神经细胞跨膜电位的变化，从而影响疼痛信号的传导。

图2 CCI 模型大鼠下丘脑β- 内啡肽含量的比较( ±SEM )**P ＜ 0.01, 与H0 组相比; ΔΔP ＜ 0.01, 与H1 组相比; #P ＜ 0.05,与H2 组相比Fig.2 The comparison of content of Β-EP in hypothalamus of CCI model rats ( ±SEM )**P ＜ 0.01, compared with group H0; ΔΔP ＜ 0.01, compared with group H1; #P ＜ 0.05, compared with group H2

综上所述，电压45 V、55 V、65 V的2 Hz脉冲射频均可引起CCI大鼠热痛阈值的升高，镇痛效果显著，这可能与其增加下丘脑β-内啡肽的含量有关；然而，电压大于55 V时，疼痛缓解没有进一步改善，但可以维持相对高的浓度，从而可能增强脉冲射频的时效性，这预示通过改变传统脉冲射频的治疗电压参数，可以改变目前治疗不满意的现状。但是由于客观实验限制，未能进行更高电压及更长时间的观察，无法确定最合适的电压参数。因此脉冲射频治疗的最适电压，还需要进一步的实验研究来证实。

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THE EFFECT OF DIFFERENT VOLTAGE PULSED RADIOFREQUENCY ON BETA-ENDORPHIN LEVEL IN THE HYPOTHALAMUS AFTER CHRONIC CONSTRICTION INJURY IN RATS

JI Gao-Liang1, XUE Zhao-Xia2Δ, GENG Bao-Liang3, LIU Wang1
(1Department of Anesthesiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;2Department of Pain,Shanxi Medical University First Hospital, Taiyuan, 030001, China;3Department of Pain, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital subsidiary Fourth, Shenyang 110100, China)

Objective:To observe the effect of different voltage pulsed radiofrequency (PRF) on the content of beta-endorphin in the hypothalamus of CCI rat model, and to explore the analgesic mechanism of pulsed radiofrequency.Methods:Seventy-two male SD rats were randomly divided into 4 groups (n=18): Sham operation group H0, PRF low voltage group H1 (45 V), PRF medium voltage group H2 (55 V), PRF high voltage group H3 (65 V). All rats underwent chronic constriction injury of sciatic nerve. On the 7th postoperative day in PRF groups, PRF was delivered with a pulse duration of 20 ms (500 kHz) and pulse rate of 2 Hz to the proximal sciatic nerve for 2 min. The treatment voltage was 45 V, 55 V and 65 V respectively;While in H0 group, PRF needles were placed in the proximal sciatic nerve for 2 min without radiofrequency current. Pain behavioral changes were measured before operation, 7 days after operation, and 1, 7, 14 days after PRF treatment. The expression of beta-endorphin was measured in the hypothalamus of CCI rat(n=6) in each group at l, 7, 14 days after PRF treatment.Results:At 1, 7, 14 days after PRF treatment, paw withdrawal thermal latency (PWTL) of PRF groups were all increased signi fi cantly comparing with sham operation group (P＜ 0.01). On the 7th day after the operation, PWTL of the medium and high voltage group was signi fi cantly higher than the low voltage group (P＜ 0.01). At the end of the experiment, the expression of beta-endorphin in PRF groups were signi fi cantly higher than sham operation group (P＜ 0.01). On the 7th day and 14th after the operation, the expression of beta-endorphin of the medium and high voltage group were increased significantly comparing with the low voltage group (P＜ 0.01). On the 14th day after the operation, there were differences between medium and high voltage group (P＜ 0.01).Conclusion:PRF(frequency 2 Hz) of the low, medium and high voltage group can all cause the increase of the PWTL of CCI rats, which may be related to the increase of the content of beta-endorphin in the hypothalamus. When the pulsed radiofrequency voltage is greater than 55V, the treatment effect is not improved further.

Pulsed radiofrequency; Different voltage; CCI rat; Neuropathic pain; Beta-endorphin

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.06.005

△通讯作者 xzx1284@126.com