超滤膜法提取水相中茶皂素的研究

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(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

超滤膜法提取水相中茶皂素的研究

顾姣,杨瑞金*,张文斌,赵伟,华霄

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

本文以乙醇水提法提取油茶籽油后产生的水相副产物为原料,利用超滤膜法对其中丰富的茶皂素进行分离提纯。主要探索了超滤膜材料、膜孔径、茶皂素浓度、水相pH以及超滤后期加水量对茶皂素透过率以及纯度的影响。结果表明:采用截留分子量为10 k的改良纤维素复合膜(PLCGC)进行超滤,同时将水相稀释4倍至茶皂素浓度为13.13 mg/mL,pH调节至7.0,超滤后期加3倍体积的水恒容超滤,茶皂素透过率可达64.39%,纯度达84.16%。对纯化后的茶皂素进行红外光谱及液质分析,证明超滤法可以有效分离提取水相中茶皂素,实现提油后水相副产物的回收利用。

超滤膜,分离纯化,水相,茶皂素

茶皂素是一种天然非离子型表面活性剂[1],具有优良的起泡性、稳泡性、分散性、乳化性和润湿性等性能[2-3]。茶皂素主要由糖体、有机酸和皂苷元组成,近年来研究发现,茶皂素还具有抑菌[4-5]、抗渗消炎[6-7]、降低血脂胆固醇[8]、抗癌[9-10]和保护肠胃等生物活性[11],具有广阔的应用前景和经济价值。

油茶是世界四大木本油料作物之一,主要种植在我国江西、湖南和福建等地,油茶籽中约含20%～25%茶皂素,是提取茶皂素的主要来源。传统提取工艺是以压榨法制油后得到的茶枯饼为原料,用有机溶剂或水浸提,此方法颜色深,提取率低,试剂消耗大,经济成本高[12],不适合产业化生产。江南大学酶学课题组率先研究了乙醇水提法提取油茶籽油的新工艺[13],使得油茶籽油提取率提高至96.66%,同时由于乙醇的作用可将茶籽中茶皂素同步提取到水相中,实现油茶和茶皂素的同步提取。因此对水相副产物中茶皂素进行提取纯化,不但能减少工艺废水排放带来的环境污染,更能有效的对水相进行回收再利用,增加经济效益和生态效益。

膜分离是利用外界能量或者化学位差为推动力,在选择性透过膜的两侧,根据物质能否透过膜或者透过速率的不同,实现物质的分离、分级或者浓缩的技术[14]。对比有机溶剂浸提法或硅胶柱层析等分离手段,膜分离过程不会改变物质本身的结构,不产生相变,具有耗能低,工艺简单,污染小等优点,现在被广泛的应用在食品加工工业中[15-16]。本研究以乙醇水提法提取油茶籽油过程中产生的水相为原料,利用超滤膜法对茶皂素进行分离纯化,并探究了超滤膜材料、超滤膜孔径、pH、料液浓度、后期加水体积等因素对超滤效果的影响,以期能为皂苷类物质的膜分离提供理论指导。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

油茶籽 江西绿野轩生物和技术有限公司提供;茶皂素标准品(98%),乙醇,氢氧化钠,盐酸,香草醛,硫酸,苯酚,硫酸铜,硫酸钾等均为分析纯,乙腈、甲醇、甲酸,均为HPLC级 国药集团化学试剂有限公司。

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Pellicon切向流超滤系统、蠕动泵 美国Millipore公司;改良纤维素超滤膜(截留分子量3、5、10、30 kDa)、聚醚砜超滤膜(截留分子量为10kDa)、pH适用范围为2～11,温度适用范围是4～50 ℃、WK-1000中药粉碎机 山东省青州市精诚机械有限公司;MP-501A超级恒温循环槽 上海一恒科技有限公司;LXJ-IIB离心机 上海安亭科学仪器厂;酶反应器 上海华科玻璃制品公司;磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;UV-1100分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;DCAT21全自动表面张力仪 德国德菲公司。

1.2.4 表面张力的测定 使用DCAT21全自动表面张力仪,采用Wilhelmy Plate法测定不同浓度的茶皂素水相的表面张力[19]。

1.2.1 茶皂素水相提取液的工艺流程 油茶籽→粉碎→乙醇水提法提取油茶籽油→离心(离心力3500 g,10 min)→所得水相即为茶皂素水相提取液。

茶皂素的相对分子质量仅为1.2 kDa左右,但图1中3 kDa超滤膜可截留75.67%的茶皂素,并且通量极小。最可能的原因是因为茶皂素作为一种天然的非离子型表面活性剂,在溶液中通常以胶束化状态存在,胶束使得茶皂素分子聚集在一起,体积变大[24],使得超滤过程中浓差极化的现象变严重,透过效果变差。并且,当溶液中还存在蛋白质、多糖等杂质的时候,胶束在形成过程中还会与一些杂质结合,使得胶束的体积更大,更加剧了超滤过程的难度,使得超滤膜孔径的选择必须远远大于茶皂素单分子的相对分子质量。这与顾春雷[25]、程文娟[26]等的研究结果相似,随着膜孔径的增加,茶皂素的透过率不断增加。因此选择10 kDa的复合纤维素膜超滤。

1.2.2.1 茶皂素测定 采用香草醛-浓硫酸显色法测定茶皂素含量[17]。准确称取茶皂素标准品,用80%的乙醇溶液配成1 mg/mL标准溶液,分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 加入10 mL具塞试管中,用80%乙醇补充至0.5 mL,冰水浴下加入0.5 mL 8%的香草醛乙醇溶液,再加入4 mL 77%的硫酸溶液,混匀后在60 ℃水浴20 min,冰水浴10 min,在545 nm处测定吸光值。并以茶皂素浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标做茶皂素标准曲线。

1.2.2.3 粗脂肪的测定 索氏抽提法,GB/T 5009.6-2003。

1.2.2.4 总糖的测定 苯酚硫酸法[18]。

1.2.2.5 水分测定 105 ℃烘箱法,GB/T 5009.3-2003。

生物裂解燃油（PBF）与生物柴油同属于生物质有氧燃料，但组分的碳链长度及碳键特征差异比较明显，生物柴油组分的碳链长度集中在C16 ～ C18，且碳碳双键（不饱和键）组分比例较高。而生物裂解燃油的组分碳链长度分布更为广泛，短链组分占有较高比重，且不饱和组分明显较少。石化柴油组分以烷烯烃为主，不含氧元素，分子结构明显不同于生物燃料。对包括 WME和JME在内的大部分生物柴油而言，由于其制备工艺的相似性，所获得的燃料尽管组分类别及含量有一定差异，但均含有较高比重的不饱和成分，可称为高不饱和度生物燃料[11]。

（2）对于手工滴定分析与色谱分析存在的差距，从化学滴定分析的局限性进行分析和讨论，手工滴定的分析原理为：

图1 超滤系统示意图Fig.1 Sketch chart of ultrafiltration system注：1:循环水浴槽;2:料液器;3:蠕动泵;4:进口压力表; 5:超滤膜;6:透过液接收器;7:出口压力表;8回流液阀。

1.2.3.1 超滤膜孔径的确定 茶皂素是一种五环三萜类皂苷,平均分子式为C57H90O26,相对分子质量在1200左右,因此选择截留分子量为3、5、10、30 kDa的改良纤维素复合膜以及截留分子量为10 kDa的聚醚砜膜进行实验。将水相溶液稀释4倍至茶皂素浓度约13.13 mg/mL后,在自然pH下,控制超滤压力为0.5 MPa,超滤温度40 ℃,根据超滤过程中茶皂素透过率、茶皂素纯度以及超滤过程的通量来确定最佳的超滤膜孔径。

1.2.3.2 初始茶皂素浓度的确定 将初始水相提取液分别稀释2、3、4、5、6倍后,在自然pH下,保持超滤压力0.5 MPa,控制超滤温度为40 ℃,过10 kDa超滤膜(膜材料:改良纤维素复合膜),根据茶皂素透过率、透过液的纯度以及超滤通量的大小确定最佳的初始料液浓度。

由上述可以发现，在很多情形下，用典论总是与宗经与否联系在一起的。一般说来，宗经派不会简单否定用典，而是强调用典的雅正与恰当；且其倡扬之用典，所指大多还不是诗文等文学作品。如前述刘勰《文心雕龙·隶事》所谓“缘古证今”“据事类义”，大多皆为论说类理论文章。其实就这一点而言，钟嵘与刘勰并没有多大区别，钟氏亦云“经国文符，应资博古；撰德驳奏，宜穷往烈”。因此，在吟咏情性的诗文之中，究竟是否应该用典，用典与吟咏情性知否构成矛盾？才是南朝用典论争执之焦点。

1.2.3.3 超滤过程pH的确定 将水相提取液稀释4倍至茶皂素浓度约13.13 mg/mL后,调节pH分别为4、5、6、7、8、9、10,保持超滤压力0.5 MPa,控制超滤温度40 ℃,过10 kDa超滤膜(改良纤维素复合膜),根据茶皂素透过率,透过液纯度以及超滤通量的大小确定最佳的初始料液浓度。

1.2.3.4 超滤后期加水量的确定 前期实验发现,在超滤后期加水会将部分吸附在超滤膜上的茶皂素洗脱下来,增加茶皂素的得率,因此在超滤后期分别加1、2、3、4倍水相体积的水来回收茶皂素,继续收集透过液,根据茶皂素透过率选择合适的加水量。

1.2实验方法

以上是8极电机定子冲片6拼(重叠数为2，圆周共12条拼缝)产生轴电流的机理。如果把扇形片拼数改为8拼(重叠数为2，圆周共16条拼缝)，此时磁通路径示意图则如图3所示。

屋外，雨还在淅淅沥沥地下着，透过雨幕可以清晰地看到枝头绽开的蓓蕾，在雨丝的飞舞中顽强地支撑起绿色的生命。竹韵心想，自己在这淅沥春雨中已走进了陪伴英雄的第九个春天，这个春将给她带来什么呢？

为便于问题的分析，本文进行如下形式化描述.计算资源VMi={Mi1，Mi2，Mi3，…}，其中Mi1，Mi2，Mi3，…分别表示内存大小、CPU数目、运行成本、CPU执行的指令数目等.假设系统中用户提交的任务记为TKj={Kj1，Kj2，Kj3，…}，其中Kj1，Kj2，Kj3，…为任务的多个属性，如任务长度、输入文件大小、输出文件大小等.对于第j个任务TKj和第i个资源VMi任务的执行时间为TimeCost(TKj→VMi).则一个完整的云计算资源调度方案S，其总完成时间为

1.2.5 纯化后茶皂素红外光谱的测定 将纯化后茶皂素粉末用KBr压片法压片,进行红外光谱的测定。在玛瑙研钵中加入适量茶皂素粉末和KBr,在红外灯下将其磨成细粉,在压片机中压成圆形透明的薄片后,在红外光谱测定仪中测定,波长范围300～4000 cm-1。

向南就是易非的大弟弟。他在外面晃着，搞摄影，看上去是风光无限，微博和空间频繁更新，不是香车就是美女，再就是美食，可就是没拿一分钱回家，反倒隔三差五的找妈要。最近在易非的阻止下，他没找妈要，倒找乡亲们借上了。

1.2.6 LC-MS 测定方法 色谱条件:色谱柱:BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:A:乙腈;B:2%的甲酸水溶液;流速:0.3 mL/min;梯度洗脱:0 min:10% A,90% B;15 min:30% A,70% B;16 min:100% A,0% B;17.1 min:10% A,90% B;20 min 10% A,90% B;紫外检测器,检测波长:210 nm;柱温:室温。

质谱条件:数据采用电喷雾负离子模式(ES-);毛细管电压3.0 kV;锥孔电压:20 V;碰撞能量:20 Volt;质谱扫描范围:m/z 20～2000。

综上所述，新时期，小学语文教师在实际展开教学活动的过程中，必须对阅读和写作之间的联系产生深刻认知，并从通过阅读篇章引导学生展开仿写与续写、通过读写结合提升学生语文能力、培养学生阅读中记录笔记的习惯等角度出发，为提升小学语文教学质量奠定基础。

1.2.7 超滤过程计算公式

表1 提油水相中各成分含量(w/w)Table 1 Analysis of the ingredient of aqueous phase(w/w)

式(1)

1.2.2.2 粗蛋白测定 凯氏定氮法,GB/T 5009.5-2003。

式(2)

茶皂素的截留率 Pi(%)=(1-Ts)×100

式(3)

1.2.3 超滤膜系统及超滤过程实验方法 将一定体积的茶皂素水相溶液离心(4000 g,15 min),取上清液过滤后加入料液器中,外连超级恒温水浴循环槽保温。超滤装置如图1所示,超滤时利用蠕动泵将料液泵入到超滤装置中,通过出口阀及进料速度调节超滤过程的压力。收集透过液,同时使截留液流回料液器不断进行循环。

式(4)

式中:J:膜通量-mL/(m2·min);V:透过液体积-mL;S:膜的有效面积-m2;t:超滤时间-min;m0:原水相中茶皂素的总质量-mg;m1:透过液中茶皂素的总质量-mg;M:透过液中的总的固形物含量-mg。

1.3数据处理

所有实验做3次平行,使用统计分析软件SPSS Statistics 17.0对数据进行分析,实验中显著性差异为p<0.05。

2 结果与分析

2.1茶皂素水相成分分析

表1为水相中成分含量表。在乙醇水提法提取油茶籽油工艺中使用15% (v/v)乙醇作为提取溶剂,在此过程中茶皂素不断被提取至水相中,实现了茶籽油和茶皂素同步提取[20]。因此在表1中可以看出,工艺水相中茶皂素含量达到5.25% (w/w),茶籽中茶皂素含量为20%～25% (w/w),根据物料衡算,溶解在水相中的茶皂素占原料茶籽仁中茶皂素总量的80.88%,即茶仁中绝大部分茶皂素都转移到水相中,因此乙醇水提法水相是理想的提取茶皂素的原料。但上述水相除茶皂素外,还有蛋白质、多糖、色素等杂质,使水相色泽较深,茶皂素纯度较低,因此需要进一步对茶皂素水相进行分离纯化。

2.2超滤膜孔径的选择

因此，人工智能的发展态势是趋向于“与人相同”的，为了让人工智能能“做人的工作”，人类必然会不断将本来仅为人类所具有的能力赋予人工智能，并让人工智能表现得越来越像人。人工智能的这种特性可以称之为“近人性”。更重要的是，必须看到，这种思想观念其实在今天相当普遍地存在着，Google Assistant的演示中的那句“Hmm”引起了观众的强烈反映，恰恰反映出人类对人工智能的“近人性”的认同；而“为何不少研究者对人工智能的研制、普通人对人工智能的想象，都是以人型人工智能为依归”的问题，也可从中找到部分的解释。

超滤是利用膜的筛分性质,以压差为传质推动力,将不同分子质量的溶质分离的一种纯化方法。超滤膜孔径越小,被截留的物质越多,膜的通量越低,浓差极化现象越严重,膜污染不断加重[21],因此超滤膜孔径对于茶皂素的纯化非常关键。图2(A)表示的是不同孔径和材料的超滤膜的茶皂素透过率和纯度,由图可知,10 kDa聚醚砜膜茶皂素透过率仅为37.33%,而10 kDa复合纤维素膜透过率为58.59%。说明聚醚砜膜不适用于茶皂素的纯化。王旭东[22]曾研究过不同膜材料对超滤过程的影响,认为膜的亲水性程度和膜的结构性质均会影响膜污染的程度。聚醚砜材料本身因其疏水性,使其很容易受污染而通量下降[23],可见,复合纤维素膜对茶皂素透过效果优于聚醚砜膜。在图2(A)中可知,随超滤膜孔径的增加,茶皂素透过率不断增大,10 kDa时茶皂素透过率达到最大为58.59%,图2(B)中也可以看出，此时透过液测膜通量明显高于其他孔径的膜,30 kDa时茶皂素透过率与10 kDa时没有显著差异(p>0.05),但由于30 kDa膜孔径太大,导致大量蛋白质、多糖等杂质透过,使透过液中茶皂素纯度比10 kDa时显著下降(p<0.05)。综合选择10 kDa改良纤维素复合膜进行实验。

图2 超滤膜孔径对茶皂素超滤效果的影响Fig.2 Effect of different membrane aperture on the ultrafiltration of tea saponin注：A:对茶皂素透过率和纯度影响;B:对膜通量的影响。 不同字母表示差异显著(p<0.05),图3,图5,图6同。

1.2.2 成分分析方法

2.3最佳初始茶皂素浓度的选择

图3是10 kDa改良纤维素超滤膜对不同浓度(以稀释后浓度的对数表示)茶皂素的分离纯化效果。随水相稀释倍数增加,茶皂素浓度不断降低,茶皂素透过率缓慢增加,稀释4倍即茶皂素浓度约为13.13 mg/mL时,茶皂素透过率达到最大,为58.59%,继续稀释,茶皂素透过率变化不大,但随稀释倍数增加,小分子的蛋白质、糖等杂质会不断透过,使茶皂素纯度有明显降低,因此选择13.13 mg/mL为初始茶皂素浓度。有研究指出,随茶皂素浓度的增加,形成的胶束也会不断变大,先形成球状胶束,接着会形成棒状胶团,浓度更大时还会形成巨大的层状胶团,阻止茶皂素透过[27]。因此,降低茶皂素浓度是减缓胶束形成,增加茶皂素透过率的有效方法。图4是水相中茶皂素浓度与表面张力的关系,随茶皂素浓度的增加,水相溶液的表面张力不断下降,当达到临界胶束浓度时,表面张力趋向稳定。因此不断对水相溶液稀释,茶皂素浓度变小,有利于减慢胶束化状态,更有利于超滤的进行。

图6反映了地震波在地下倾斜状矿体模型中传播状态。t=80 ms时，由于倾斜体自身特征原因，当S波到达倾斜矿体，以一定的倾角入射到介质体分界面，P波与S波在遇到分界面处发生反射、透射以及散射，各种波之间相互叠加。

图3 水相稀释倍数对膜法纯化茶皂素效果的影响Fig.3 Effect of different dilution ratios on tea saponin purification by ultrafiltration

图4 水相中茶皂素的表面张力与质量分数的关系Fig.4 The relation between the concentration of tea saponin and the surface tension

图5 不同pH的茶皂素水相对膜法纯化茶皂素效果的影响Fig.5 Effect of different pH on tea saponin purification by ultrafiltration

2.4超滤过程中pH的选择

图5是不同水相pH下的超滤纯化效果,发现总体酸性条件下茶皂素透过率略低于碱性条件下的,而在中性条件pH7时茶皂素的透过率达到最大,为64.39%,透过液中茶皂素纯度也随pH增加而增加,并在pH7时,纯度达到70.37%,之后趋向稳定。

茶皂素本身pH在5.0～6.5,在稀碱性溶液中溶解性会明显增大[28],因此水相溶液pH会影响茶皂素溶解度,从而影响超滤效果。有研究报道,pH还会对胶束的存在产生影响[29]。刘立伟等[30]用原子力显微镜分析不同碱浓度下胶束的几何尺寸,添加少量的碱会使胶束颗粒先变小后变大。所以微碱性环境中茶皂素透过率会优于酸性环境。但是在碱性条件下蛋白质等溶解性也会增强,使杂质等透过率增加,使得碱性条件下透过液中茶皂素的纯度降低,而且碱性较强时,茶皂素会逐渐被水解,结构可能遭到破坏。因此选择pH7作为最优条件进行深入的研究。

2.5超滤后期加水量对茶皂素得率的影响

随着超滤进行,料液器中溶液浓度逐渐升高,茶皂素分子胶束化严重,加剧了超滤膜两侧浓差极化现象,膜通量迅速下降,为了增加茶皂素得率,采用恒容超滤形式在超滤后期加不同体积的水。图6为超滤后期不同加水量对茶皂素透过率的影响,随加水量增加,使得料液器中溶液被稀释,茶皂素在胶束状态下解脱出来,有利于增加茶皂素透过率。当加3倍初始体积水后,茶皂素透过率从44.88%增加至59.77%,继续增大加水量茶皂素透过率无显著性变化(p>0.05),因此选择1∶3加水量作为超滤后期加水量的最佳条件。

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图6 不同加水量对茶皂素透过率的影响Fig.6 Effect of different amount of water for washing membrane on tea saponin purification by ultrafiltration

根据超滤工艺的优化条件将水相稀释4倍至茶皂素浓度约为13.13 mg/mL时,pH调节至7.0后过10 kDa改良纤维素复合膜,并在后期恒容超滤过程中加3倍体积的水,最终茶皂素透过率可达64.39%,纯度达84.16%,将纯化后的茶皂素产品进行相关性质分析。

3 产品分析

图7为所制得的茶皂素粉末样品与茶皂素标准品的红外光谱图,它们的主要官能团基本相符,且纯度较高。

表2 茶皂素的质谱分析Table 2 MS analysis of tea saponin

图7 红外光谱图Fig.7 Infrared spectrum注：A:标准品;B:超滤后茶皂素粉末。

将超滤透过液通过LC-MS分析,如图8为负离子模式下的液相图。茶籽中的茶皂素和黄酮类物质在结构和性质上有一定的相似性,并且由于茶皂素本身结构的多样性和复杂性,给茶皂素结构鉴定带来一定难度[31]。黄酮类物质的主要紫外吸收集中在240～4000 nm 左右,茶籽中黄酮相对分子量集中在590～750左右,结合文献[32-33]报道,采用210 nm处紫外吸收作为茶皂素检测波长。茶皂素主要相对分子质量在1100～1300之间,结合质谱分析,得出茶皂素各个单体的出峰时间集中在9～15 min,表2列出了主要的茶皂素质谱分析结果,发现油茶籽水相提取液中茶皂素[M-H]-主要集中在1103～1231之间,同时茶皂素碎片中[M-H]-频繁出现的504和518等,被认为是皂苷元片段,这与已经报道[34-35]中的11种皂苷元的分子量有所差异,但具体结构仍需要进一步的分析。

图8 茶皂素的液相图Fig.8 Chromatogram of tea saponin

4 结论

乙醇水提法是新型水媒法提油工艺的一种,是近几年来迅速发展的提油新工艺。伴随新工艺产生的大量水相副产物成为亟待解决的重点。本文就是对乙醇水提法提取油茶籽油后产生水相副产物进行回收利用。根据水相中茶皂素存在特点和状态,利用超滤手段对茶皂素进行分离纯化,并优化超滤工艺条件:将水相稀释4倍至茶皂素浓度约13.13 mg/mL,pH调节至7.0后过10 kDa改良纤维素复合膜,并在后期恒容超滤过程中加3倍体积水,最终茶皂素透过率可达64.39%,纯度达84.16%。纯化后的茶皂素与文献报道一致,相对分子质量集中在1103～1231之间。超滤法纯化茶皂素的工艺可与乙醇水提法提油工艺配套生产,能够有效解决水相副产物回收问题,延长油茶产业链,增加生产的经济价值和环境价值。

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Studyonextractionofteasaponinbyultrafiltrationfromtheaqueousphase

GUJiao,YANGRui-jin*,ZHANGWen-bin,ZHAOWei,HUAXiao

(State Key Laboratory of Food Science & Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

This article mainly aimed at the aqueous phase obtained from the extraction of the camellia seed oil with ethanol solution and studied the separation of tea saponin by ultrafiltration method. Material of ultrafiltration membrane,the aperture of the membrane,the initial concentration of tea saponin,the pH of the aqueous phase and the amount of water added in later period of ultrafiltration were studied to explore their effects on the yield and purity of the tea saponin. The results showed that when 10 k membrane of PLCGC material was used and diluting the aqueous phase to 4 times(13.13 mg/mL tea saponin),adjusting the aqueous phase pH as 7.0 and adding 3 times water during later ultrafiltration period,the transmittance ratio and purity could reach 64.39% and 84.16%. Characterize the final purified tea saponin by IR and LC-MS. The result showed the tea saponin was in a high purity and it basically conformed to the features of standard substance. Therefore,ultrafiltration was an effective method to separate the tea saponin from the aqueous phase.

ultrafiltration;separation and purification;aqueous phase;tea sapasion

2017-03-29

顾姣(1991-),女,硕士研究生,研究方向:天然活性成分的提取与利用,E-mail:shiangujiao@163.com。

*

杨瑞金(1964-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:食品化学和食品科学,E-mail:yrj@jiangnan.edu.cn。

国家863计划重点项目课程(2013AA102103)。

TS229

B

1002-0306(2017)21-0180-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.036