溃疡性结肠炎患者β-内啡肽表达与免疫功能变化的相关性

刘 琳，刘 丽，张 蕊，赵东强，刘学臣，张 迪

(1.河北医科大学第二医院 消化内科，河北 石家庄 050000；2.邯郸市中心医院 消化内科，河北 邯郸 056000)

·论著·

溃疡性结肠炎患者β-内啡肽表达与免疫功能变化的相关性

刘 琳1，2，刘 丽1，张 蕊1，赵东强1，刘学臣1，张 迪1

(1.河北医科大学第二医院 消化内科，河北 石家庄 050000；2.邯郸市中心医院 消化内科，河北 邯郸 056000)

目的探讨β-内啡肽(β-EP)对溃疡性结肠炎(UC)患者免疫机制的调节作用。方法UC患者30例，轻度活动期8例，中度活动期10例，重度活动期12例。同期结肠息肉患者15例为对照组。采用放射免疫法检测血液中β-EP、白细胞介素1β(IL-1β)的表达水平，同时应用免疫组织化学染色方法检测结肠黏膜组织中β-EP 、IL-1β的表达水平；采用流式细胞术对血浆中的T细胞亚群 (CD3+、CD4+、CD4+/CD8+)表达进行检测。结果病例组血液中β-EP、IL-1β、CD4+、CD4+/CD8+各项指标的表达水平均明显高于对照组(P<0.05)；且随病情严重程度不同，其表达水平也有差异，依次为：轻度活动组<中度活动组<重度活动组(P<0.05)。血浆中β-EP分别在活动期和缓解期的变化与IL-1β、CD4+、CD4+/CD8+的变化呈正相关(r=0.522，P<0.01；r=0.532，P<0.05；r=0.964，P<0.01)。结论β-EP通过调节T细胞亚群及IL-1β的分泌参与了UC免疫机制的调节，在一定程度上可以反映UC患者病情的严重程度。

结肠炎， 溃疡性；β内啡肽；白细胞介素1β；T淋巴细胞亚群；免疫调节

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)是一种病因尚不十分明确的慢性非特异性炎症性肠道疾病，其特点是病情常反复发作，难以治愈，且有一定的恶变率。其病因学的研究一直是热点和难点[1]，包括氧化应激[2]、肠道菌群失调[3-4]、细胞凋亡、遗传、免疫、饮食等方面。目前大部分研究表明免疫调节紊乱是UC发病的中心环节，T细胞亚群及细胞因子失调在UC发病中起着重要的作用。

β-内啡肽(β-endorphin， β-EP)是人体内生成的阿片活性物质， 可通过与免疫细胞表面的阿片受体及非阿片受体结合，介导免疫调节作用，在自身免疫性疾病及脑血管疾病等方面的研究较多，但关于β-EP在UC中的研究目前国内外鲜有报道。

通过检测UC患者结肠组织及血浆中β-EP的表达，分析UC活动期及缓解期血浆中β-EP的变化与T细胞亚群、白细胞介素1β(IL-1β)变化的相关性，探讨β-EP在UC免疫调节中可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1病例选择 收集2011年3月至2012年2月就诊于河北医科大学第二医院消化内科门诊及病房的UC患者共30例，留取患者处于病情活动期时的外周静脉血及结肠黏膜活检组织，并收集病情缓解期的外周静脉血。其中男14例，女16例，年龄17～59岁，平均年龄38.1岁。入选病例均符合2012年中华医学会消化病学分会对炎症性肠病诊断与治疗的共识意见中UC的诊断标准[5]。按照Southerland DAI标准分为轻度、中度以及重度活动期，其中包括轻度活动期患者8例，中度活动期患者10例，重度活动期患者12例。另外，选取同时期结肠息肉患者15例作为对照组，留取其外周静脉血及正常结肠黏膜组织。其中男7例，女8例，年龄21～62岁，平均年龄40.1岁，对照组血常规、生化全项、结肠镜、病理学等检查均无明显异常，并排除糖尿病、心脑血管疾病、恶性肿瘤及已经确诊的自身免疫性疾病等。各组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2研究方法

1.2.1主要试剂 人β-EP放免试剂盒购自第二军医大学神经生物学教研室；人碘[125]IL-1β放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所；荧光标记单克隆抗体和溶血素购自美国Beckman Coulter公司；鼠抗人β-EP单克隆抗体和鼠抗人IL-1β单克隆抗体购自武汉博士得生物工程有限公司。

1.2.2放射免疫分析测定血液中β-EP和IL-1β的表达 晨起空腹条件下取肘静脉血4 ml，β-EP采血管中加入0.3 M EDTA-Na2溶液40 μl、抑肽酶30 μl，IL-1β采血管中加入EDTA-K2溶液轻缓混匀， 迅速低温离心机离心(3 000 r/min，10分钟)，取血浆，于-80 ℃冰箱保存。测定时在室温下自溶。试管编号；加样，IL-1β依照平衡饱和操作，β-EP依照顺序饱和加样程序加样；孵育24小时；分离剂分离，弃上清；γ-放射免疫计数器上测量每管沉淀的cpm值。

1.2.3免疫组织化学法测定结肠黏膜组织中β-EP和IL-1β的表达 由内镜医师行电子结肠镜检查及黏膜活检，于UC和对照组患者直肠和乙状结肠交界处，取活检组织2块，置入4%的多聚甲醛溶液固定24小时；常规石蜡包埋连续切片。一块组织行HE染色，另一块组织行免疫组织化学染色：滴加山羊血清封闭液；滴加一抗 (稀释1∶100)， 4 ℃过夜；滴加生物素标记二抗 (羊抗鼠)；滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液；DAB显色，苏木精复染，盐酸酒精分化；脱水、透明、封片、镜检。

1.2.4流式细胞术测定血浆中T细胞亚群的水平 清晨空腹取肘静脉血1 ml，EDTA-K2抗凝，室温下不超过18小时检测。取流式专用试管1支，分别加入5 μl CD3-PC5、10 μl CD4-FITC、10 μl CD8-PE，立刻加抗凝血50 μl；后加入溶血素及PBS混匀，离心(1 500 r/min，5分钟)，弃上清，留细胞沉淀；上机分析，采用CellQuest软件进行上样，由软件自动统计出所需结果。

2 结 果

2.1血液中各细胞因子水平的表达

2.1.1血液中β-EP、IL-1β的表达水平 UC患者活动期与缓解期患者血液中β-EP、IL-1β的表达水平明显高于对照组(P<0.05)；且活动期β-EP、IL-1β的表达水平为：重度活动组>中度活动组>轻度活动组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

2.1.2血液中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表达水平 UC患者活动期与缓解期患者血液中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表达水平均较正常对照组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；且活动期CD4+、CD4+/CD8+的表达水平为：轻度活动组<中度活动组<重度活动组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，2。

表1 血液中UC活动期、缓解期与对照组各细胞因子表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05； 与UC缓解期比较，#P<0.05

表2 UC各组与对照组血液中各细胞因子表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度活动组比较，#P<0.05；与中度活动组比较，△P<0.05

2.2结肠组织中细胞因子的表达

2.2.1光学显微镜下表现 对照组结肠黏膜上皮完整，固有层内可见少量炎性细胞浸润，腺体排列整齐；UC各组结肠黏膜镜下表现为弥漫性炎症，固有层内可见大量炎性细胞浸润，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、单核细胞等，并且隐窝结构紊乱，部分破坏，隐窝内及隐窝上皮均可见大量中性粒细胞等炎性细胞浸润，并可见潘氏细胞化生。见图1。

图1 各组结肠黏膜组织HE染色(×200) a.对照组；b.轻度活动组；c.中度活动组；d.重度活动组

2.2.2免疫组织化学染色结果 在对照组结肠黏膜中，β-EP及IL-1β主要表达在黏膜的上皮细胞及腺上皮细胞，胞浆呈棕黄色; UC结肠黏膜中可见大量炎性细胞浸润，伴有不同程度的隐窝结构破坏，β-EP及IL-1β在UC患者结肠黏膜组织中也主要表达在上皮细胞及腺上皮细胞，阳性细胞要比正常结肠黏膜组织染色深，且阳性细胞的数目明显增多。见图2，3。

图2 UC患者结肠黏膜β-EP免疫组织化学染色(×400) a.对照组；b.轻度活动组；c.中度活动组；d.重度活动组

图3 UC患者结肠黏膜IL-1β免疫组织化学染色(×400) a.对照组；b.轻度活动组；c.中度活动组；d.重度活动组

2.2.3结肠黏膜组织中β-EP、IL-1β的表达水平 UC结肠黏膜组织中β-EP、IL-1β的表达明显高于对照组(P<0.05)；各组β-EP和IL-1β表达水平均依次为：轻度活动组<中度活动组<重度活动组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 UC各组与对照组结肠黏膜组织中β-EP、IL-1β表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度活动组比较，#P<0.05；与中度活动组比较，△P<0.05

2.3相关性分析 血浆中β-EP在UC活动期与缓解期的变化与CD4+的变化呈正相关(y=0.0365x-11.056，r=0.532，P=0.032)；与CD4+/CD8+的变化呈正相关(y=0.0891x-0.3226，r=0.964，P=0.000)；与IL-1β的变化呈正相关(y=0.0055x-0.0453，r=0.522，P=0.003)。

3 讨 论

UC是一种病因以及发病机制尚不完全明确的慢性炎症性肠病，其内镜下特点为病变呈连续性、弥漫性分布，绝大多数起病于直肠，逆行向近段结肠进展，严重者甚至累及全结肠以及末端回肠。临床特点为慢性反复发作性，常累及全身多个系统和器官，如眼部病变及皮肤受损[6]。目前国内外尚没有针对UC的根治性治疗措施。UC的发病机制一直都是研究焦点与热点，主要集中在免疫[7]、遗传、氧化应激[8-9]等方面。

研究发现UC患者中其他免疫相关性疾病的发生率也是上升的[10]，如类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎等[11]。自身免疫性胰腺炎较其他原因引起的胰腺炎患者UC的发病率要高[12-13]。有研究表明，由结肠黏膜免疫系统的异常反应所导致的急慢性炎症反应在UC的发生、发展及转归过程中起着重要作用，有可能是由于抗原的持续刺激或(及)免疫调节紊乱，免疫反应表现出过度亢进和(或)难以自限性。研究发现免疫抑制药物在治疗UC方面有很好的效果，进一步说明了UC的发生发展与免疫反应失调、活跃有关[14]。T淋巴细胞作为免疫反应环节中抗原递呈的核心，同时又是非常重要的免疫调节剂之一。另外，血管内皮细胞、上皮细胞等肠道非免疫细胞也都参与了免疫炎症反应。在UC发病中T细胞功能异常起着非常重要的作用[15-16]。有研究结果显示CD4+T细胞介导的组织损伤与UC的免疫异常或紊乱有一定的相关性[17]。本研究结果表明UC患者中存在着CD4+T细胞的异常活化，CD4+T、CD4+/CD8+参与了UC的发病过程，在一定程度上反映疾病的严重程度。肠黏膜中的CD4+T细胞异常活化，可激活巨噬细胞等效应细胞，释放IL-1β、IL-6、IL-13等促炎细胞因子，使T淋巴细胞在受损肠黏膜和固有层内大量集聚，两者共同作用使T淋巴细胞凋亡抵抗增加，肠道黏膜稳态削弱，进一步导致炎症细胞和炎症递质异常，引起肠黏膜的损伤，成为UC发病过程中的中心环节。

IL-1β作为诱导UC肠道炎症反应极其重要的细胞因子之一，大量试验研究和临床研究均表明了IL-1β的升高与UC的发生发展有着密不可分的关系[17]。本试验结果证实了UC中确实存在着IL-1β等促炎细胞因子增多、免疫调节紊乱，这种异常不仅仅存在于结肠黏膜组织中，同时也存在于血浆中，其免疫紊乱程度与疾病严重程度相关，可以在一定程度上反映病情的严重程度。

β-EP是阿片类激素中最具活性和功能的代表，与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病有关[18]。β-EP在UC中的表达及作用，目前国内外研究结果尚不十分明确。仅姬培震等[19]，周天宇等[20]报道UC大鼠模型中β-EP水平较正常组明显升高。本研究结果对外周血的检测与之相符，且更进一步发现β-EP在UC患者中的表达水平随着病情严重程度的加重而进一步的升高。其可能的机制是，在UC活动期，机体的免疫功能亢进，CD4+、CD4+/CD8+表达较对照组明显升高；免疫调节紊乱，促使促炎细胞因子分泌增多，IL-1β较对照组明显升高。机体受到亢进的免疫系统进一步损伤，为了维持机体的免疫平衡状态，机体代偿性分泌β-EP介导对免疫功能的负向调节，下调分泌增多的促炎性细胞因子及免疫介质，抵抗其对机体的免疫损伤，因此β-EP在UC活动期患者中的表达上调，且随着病情炎症程度的加重逐渐升高。组织中β-EP的表达水平反映了结肠组织受到免疫损伤的程度。而血浆中β-EP的表达可能是机体对抗免疫亢进、免疫紊乱的防御反应，反映了全身炎症反应程度、免疫损伤的程度和调节免疫的能力。

为了进一步评价β-EP对UC免疫功能的影响，本研究发现β-EP变化与CD4+、CD4+/CD8+、IL-1β的变化在一定程度上呈正相关。这表明β-EP在UC的发生、发展过程中，发挥了一定的免疫抑制作用，其原因可能是通过影响CD4+、CD4+/CD8+、IL-1β来参与免疫反应调节。但是，β-EP进行细胞免疫功能的抑制性调节的分子学机制，以及它在这种抑制性调节中起多大作用需进一步研究证明。

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β-endorphinexpressionandimmunefunctioninpatientswithulcerativecolitis

Liu Lin1，2， Liu Li1， Zhang Rui1， Zhao Dongqiang1， Liu Xuechen1， Zhang Di1

1.DepartmentofGastroenterology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China；2.DepartmentofGastroenterology，HandanCentralHospital，Handan056000，China

LiuLi，Email：loraliu@163.com

ObjectiveTo explore the immune mechanism of β-endorphin(β-EP) in ulcerative colitis(UC) patients.MethodsThirty UC patients were enrolled， including mild activity 8 cases， moderate activty 10 cases and severe activity 12 cases. In the same period，15 patients with colon polyps served as control group. Blood β-EP and interleukin-1β(IL-1β) were measured by radioimmunoassay. After peripheral blood lymphocyte separation， CD3+T cells， CD4+T cells and CD4+/CD8+T cells percentage were detected by flow cytometry. β-EP and IL-1β in colon mucosa were measured by immunohistochemistry.ResultsPlasma expressions of β-EP， IL-1β， CD4+T cells， CD4+/CD8+T cells percentage in patients with UC were significantly higher than those of control group (P<0.05). And the expressions showed significant difference with the disease severity: patients with mild UC

colitis， ulcerative; beta-endorphin; interleukin-1beta; T-lymphocyte subsets; immunomodulation

刘丽， Email：loraliu@163.com

R574.62

A

1004-583X(2017)11-0969-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.11.013

2017-09-28 编辑:张卫国