乌司他丁对肠道上皮细胞屏障损伤的保护作用分析

李永胜，马晓峰

(1.甘肃省人民医院 急诊科，甘肃 兰州 730000; 2.国营长风机器厂职工医院 内科，甘肃 兰州 730000)

·论著·

乌司他丁对肠道上皮细胞屏障损伤的保护作用分析

李永胜1，马晓峰2

(1.甘肃省人民医院 急诊科，甘肃 兰州 730000; 2.国营长风机器厂职工医院 内科，甘肃 兰州 730000)

目的探讨乌司他丁(UTI)对肠道上皮细胞屏障损伤的保护作用及其机制。方法培养Caco-2细胞，并建立肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的单层上皮细胞模型，随机分为空白对照组、TNF-α模型组、UTI低剂量组(5万U/kg)、UTI中剂量组(10万U/kg)、UTI高剂量组(20万U/kg)。采用Millicell电阻仪和多功能读板仪分别测定各组上皮细胞电阻(TER)和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran)，酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定白细胞介素6(IL-6)、IL-10水平，流式细胞仪测定细胞凋亡率，免疫蛋白质印记(Western blot)技术测定紧密连接蛋白闭合蛋白(occludin)和紧密黏连蛋白1(ZO-1)表达水平。结果与空白对照组相比，TNF-α模型组TER、FITC-dextran、occludin和ZO-1表达水平均明显下降，IL-6、IL-10、细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与TNF-α模型组比较，经UTI处理后，TER、FITC-dextran、occludin和ZO-1表达水平升高，IL-6、IL-10、细胞凋亡率降低(P<0.05)，其中以UTI高剂量组变化最显著(P<0.05)。结论UTI可能通过抑制炎性介质释放，调节紧密连接相关蛋白表达，抑制TNF-α诱导的肠道上皮细胞屏障功能损伤。

肠；细胞屏障；肿瘤坏死因子α；乌司他丁；紧密连接蛋白

肠道上皮细胞屏障是维持肠道屏障功能的关键[1]，肿瘤坏死因子α(TNF-α)是重要的致炎因子，可损害肠上皮细胞及其细胞间紧密结构，影响肠道屏障功能。乌司他丁(UTI)是一种广谱酶抑制剂，可抑制中性粒细胞、内皮细胞等释放的丝氨酸蛋白酶，具有抑制炎症、清除氧自由基等作用[2]。最近研究表明，UTI抗炎效果确切，对小鼠肠道黏膜损伤有保护作用[3-4]，但具体作用机制尚不明确。本研究通过建立TNF-α诱导的单层肠上皮细胞(IECs)屏障模型，从细胞功能、分子水平方面综合评价UTI对模型细胞的保护作用，并探讨作用机制，为UTI治疗肠黏膜屏障损伤提供依据，现报告如下。

1 材料和方法

1.1试剂与设备 UTI由广东天普生化医药股份有限公司提供；DMEM高糖培养基由美国GIBCO BRl公司提供；人肠上皮细胞注射株Caco-2细胞由美国ATCC公司提供；磷酸缓冲盐溶液(PBS)由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；兔抗occludin抗体由美国Abcam公司提供；兔抗ZO-1抗体由美国Santa Cruz公司提供；TNF-α、IL-6 ElISA检测试剂由上海森雄生物技术公司提供；Millicell电阻仪由Millipore公司提供；二氧化碳细胞培养箱由美国NAPCO公司提供BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪由美国Becton Dickinson公司提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养及单层上皮细胞模型的建立 用DMEM培养基培养人肠上皮细胞注射株Caco-2细胞，37 ℃、5% CO2条件下培养，隔日换液，检测跨上皮细胞电阻(TER)。体外上皮屏障形成判断标准：培养21～28天后TER明显升高，且数值稳定。

1.2.2Millicell电阻仪和多功能读板仪分别测定TER和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran) 将传代至23～31代的Caco-2细胞用于实验，实验开始后换用实验室培养液，由不含谷氨酰胺(Gln)和胎牛血清(FBS)的DMEM、10 nmol/L 4-羟乙基哌乙磺酸(HEPES)、10 g/L丙酮酸钠构成。Caco-2细胞单层以5×105/个接种于96孔板，分别在顶室与底室中加入实验室培养液100 μl和600 μl，隔天换液。显微镜下观察细胞生长情况及紧密连接的完整性。测量不同时间点TER值。细胞在实验前加入无血清培养基饥饿12小时，设置空白对照组(无TNF-α、UTI)和TNF-α处理组，TNF-α处理组分别不加入UTI或加入UTI低(5万U/kg)、中(10万U/kg)、高剂量组(20万U/kg)，每组3个复孔，孵育过夜后，空白对照组更换细胞培养液，UTI低、中、高剂量组分别给予5万U/kg、10万U/kg，20万U/kg UTI继续培养24小时。用Millicell电阻仪的两电极置入小室顶侧和基底侧测定TER值。各Caco-2细胞处理48小时，采用FITC-葡聚糖((FITC-dextran))荧光示踪法检测肠上皮细胞通透性。预热D-hank液至37 ℃，清洗Transwell顶室、底室1次，分别添加FITC-葡聚糖(1 mg/ml)100 μl、D-hank液500 μl，置于96孔板内，37 ℃、5%CO2条件下孵育2小时。取底室液体，采用多功能读板仪(芬兰Thermo公司)检测样品荧光长度，激光波长480 nm，发生光波长520 nm，重复测量5次取平均值。

1.2.3ELISA测定IL-6、TNF-α水平 将Caco-2细胞单层以5×105/L接种于24孔板，分组及干预方法同1.2.2，培养24小时后收集上清液，采用ElISA法测定各组IL-6、IL-10水平。

1.2.4流式细胞仪测定细胞凋亡率 将Caco-2细胞单层以每孔3×105/L各细胞接种于6孔板，培养过夜，分组及干预方法同1.2.2。干预24小时后吸除培养液，用PBS清洗细胞3次，制成单细胞悬液，并用PBS重悬，密度为1.0×106个/ml，加入FITC Annexin V和PI各5 μl，室温下孵育15分钟后，加入PBS 400 μl，采用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.5采用免疫蛋白质印记(western blot)技术测定紧密连接蛋白occludin、zo-1表达水平 将Caco-2细胞单层以1.0×105/L接种于24孔板，提取总蛋白，SDS-PAGE电泳，根据抗体实验说明书推荐浓度用一抗稀释液稀释对应抗体，其中兔抗occlidin抗体为1∶800，兔抗ZO-1抗体为1∶200，将封闭好的PVDF膜放入稀释一抗中，孵育过夜，TBST温床上洗膜3次。按照1∶3 000的比例用脱脂奶粉稀释二抗，与PVDF膜孵育，孵育1小时，TBST温床上洗膜3次。按照发光液试剂盒说明书吸取1 ml试剂A和试剂B，混合后滴到PVDF膜上，吸去周边多余发光剂，测量吸光度值，重复测量3次取平均值。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，计量资料采用均数±标准差(x-±s)表示，多组间比较进行方差齐性检验，如方差齐，采用单因素方差分析，如方差不齐采用Welah校正。组间多重比较在方差齐时选用Dunnett法检验，方差不齐时选用Dunnet T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TER、FITC-dextran比较 与空白对照组比较，TNF-α模型组、UTI低剂量组、UTI中剂量组、UTI高剂量组TER、FITC-dextran均明显下降(P<0.05)；与TNF-α模型组比较，UTI治疗后TER、FITC-dextra明显升高(P<0.05)，UTI低剂量组、UTI中剂量组、UTI高剂量组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 TER、FITC-dextran比较(n=3)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与TNF-α模型组比较，#P<0.05；与UTI低剂量组比较，△P<0.05；与UTI中剂量组比较，▲P<0.05

2.2Caco-2细胞单层炎性水平比较 与空白对照组比较，TNF-α模型组、UTI低剂量组、UTI中剂量组、UTI高剂量组IL-6、IL-10均明显升高(P<0.05)；与TNF-α模型组比较，UTI治疗后IL-6、IL-10明显降低(P<0.05)，UTI低剂量组、UTI中剂量组、UTI高剂量组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 Caco-2细胞单层炎性水平比较(n=3)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与TNF-α模型组比较，#P<0.05；与UTI低剂量组比较，△P<0.05；与UTI中剂量组比较，▲P<0.05

2.3Caco-2细胞单层凋亡率及紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达比较 与空白对照组比较，TNF-α模型组、UTI低剂量组、UTI中剂量组、UTI高剂量组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，Occludin、ZO-1表达水平明显下降(P<0.05)；与TNF-α模型组比较，UTI治疗后细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，Occludin、ZO-1表达水平明显增加(P<0.05)；UTI低剂量组、UTI中剂量组、UTI高剂量组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3，见图1，2。

表3 Caco-2细胞单层凋亡率及紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达的比较(n=3)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与TNF-α模型组比较，#P<0.05；与UTI低剂量组比较，△P<0.05；与UTI中剂量组比较，▲P<0.05

图1Caco-2细胞单层凋亡率分析

图2紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达A、B、C、D、E分别为空白对照组、TNF-α模型组、UTI低剂量组、UTI中剂量组、UTI高剂量组

3 讨 论

完整的肠道上皮细胞屏障是维持肠道屏障功能重要的一环，可阻止肠内大分子毒素、细菌等穿过肠壁，预防全身炎症反应(SIRS)、多器官功能障碍综合征(MODS)等发生。肠黏膜上皮细胞紧密连接完整与否直接影响肠道上皮屏障功能，一旦上皮紧密连接缺失或变异，细胞间隙通透性明显增加，肠道屏障功能被破坏[5]。紧密连接主要位于上皮细胞顶端，包括Occludin、ZO-1、claudin-2蛋白等，其中Occludin是一种扩膜蛋白，通过Occludin蛋白封闭细胞间隙，与ZO-1蛋白共同形成紧密连接的基础结构，可调控物质的细胞转运途径，是目前研究最多的紧密连接功能蛋白；ZO-1是ZO异构体最为主要的部分，可将缝隙连接(GJ)、黏附连接(AJ)连接在一起，在维持肠黏膜上皮细胞紧密连接完整性中起重要作用[5]。临床研究发现，炎性介质、肠道内细菌、细胞因子等均会导致Occludin、ZO-1等紧密连接蛋白表达异常，增加肠黏膜通透性，影响肠道屏障功能[7]。故本研究选取Occludin、ZO-1作为观察指标。

TNF-α是重要的致炎性因子之一，可通过激活肌球蛋白轻链激酶(MlCK)所接介导的肌球蛋白轻链激酶化，导致紧密连接蛋白重组，破坏肠道屏障功能，一般阻断TNF-α后，肠道屏障功能会有所恢复[8-9]。多数研究指出，TNF-α会增加肠黏膜通透性[10-11]。本实验中，我们在Transwell的上下室均加入TNF-α，以保证Caco-2单层细胞顶部和基底部均可接触到TNF-α，结果显示TER、FITC-dextra均下降，说明TNF-α会破坏Caco-2细胞单层屏障功能，增加细胞通透性增加，与Coskun等[12]研究结果一致。另外，本实验中，TNF-α模型组Occludin、ZO-1蛋白较空白对照组明显降低，提示Occludin、ZO-1蛋白表达异常，可能影响肠黏膜上皮细胞紧密连接完整性。刘行等[13]研究指出，紧密连接蛋白重新分布是TNF-α损害肠道上皮细胞功能的重要机制之一，本研究结果与其一致。

UTI主要来源于人尿的相对分子质量为67 000的糖蛋白，对丝氨酸蛋白酶、透明质酸梅、纤溶酶等多种酶有抑制作用，还可抑制白细胞释放TNF-α、IL-6等炎性介质，降低细胞毒性作用，减轻肠黏膜充血，降低肠道通透性，预防肠道细菌、内毒素移位[14-15]。Shikimi等[16]研究发现，UTI可抑制炎性介质(如TNF-α、IL-6等)释放，减轻其对器官功能的损害。周玉坤等[17]研究发现，UTI对急性重症胆囊炎所致肠黏膜损伤有保护作用，能改善紧密连接相关蛋白表达异常情况。常瑞明等[18]研究指出，UTI可通过降低炎性介质释放、降低肠黏膜Caspase-3等保护心肺复苏后大鼠受损肠黏膜。因此，我们考虑UTI可改善TNF-α诱导的Caco-2细胞屏障功能障碍。为证实这一猜想，本实验组中，加入不同剂量的UTI，结果表明加入UTI后可改善TNF-α引起的TER、FITC-dextran下降，且治疗后IL-6、IL-10明显降低，Occludin、ZO-1表达水平上调，呈现出剂量依赖性，说明UTI可上调紧密连接蛋白表达，降低肠黏膜通透性。

综上所述，TNF-α与肠道上皮细胞屏障损伤密切相关，UTI对TNF-α诱导的肠道上皮细胞屏障损伤有保护作用，其机制可能为抑制IL-6、IL-10炎性介质释放、上调紧密连接蛋白；另外，UTI对肠道上皮细胞屏障损伤的保护作用呈具有剂量依赖性。

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Protectiveeffectofulinastatinonintestinalepithelialcellbarrier

Li Yongsheng1， Ma Xiaofeng2

1.DepartmentofEmergency，GansuProvincialHospital，Lanzhou730000，China; 2.DepartmentofMedicine，GansuNationalChangfengMachineryFactoryHospital，Lanzhou730070，China

LiYongsheng，Email:zf26892@126.com

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of ulinastatin (UTI) on intestinal epithelial cell barrier.MethodsCaco-2 cells were cultured， epithelial cells monolayer models induced by tumor necrosis factor-α(TNF-α ) were established and were randomly divided into blank control group， TNF-α model group， low-dose UTI group (50 000 U/kg)， middle-dose UTI group (100 000 U/kg) and high-dose UTI group (200 000 U/kg). The transepithelial electrical resistance (TER) and fluoresce in isothiocyanate marked dextran FITC-dextran in all groups were determined by Millicell electrical resistance meter and multifunctional plate reader. Interleukin 6 (IL-6) and IL-10 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ElISA). The apoptosis rate was measured by flow cytometry， and the expression of tight junction protein occludin and ZO-1 were measured by Western blot.ResultsThe expression of TER， FITC-dextran， occludin and ZO-1 were significantly lower in TNF-α model group than those in blank control group， while IL-6， IL-10 and apoptosis rate were significantly higher (P<0.05). After UTI treatment， TER， FITC-dextran， occludin and ZO-1 were significantly higher than those in TNF-α model group， while IL-6， IL-10 and apoptosis rate were significantly lower (P<0.05). UTI change in high-dose group was the most significant (P<0.05).ConclusionUTI may protect the intestinal epithelial cell barrier injury induced by TNF-α through inhibiting the release of inflammatory mediators and regulating the expression of tight junction associated proteins.

intestines; cell mucosal barrier; tumor necrosis factor-alpha; ulinastatin; tight junction protein

李永胜，Email: zf26892@126.com

R322.45

A

1004-583X(2017)11-0953-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.11.009

2017-05-31 编辑:张卫国