绒山羊精子检测方法简介

杨文凯(辽宁省家畜家禽遗传资源保存利用中心，辽宁 辽阳 111000)

绒山羊精子检测方法简介

杨文凯
(辽宁省家畜家禽遗传资源保存利用中心，辽宁 辽阳 111000)

精液采集后应立即对其品质进行全面检查，为精液处理及使用提供参考依据。检查的内容包括：颜色、射精量、活力、密度、畸形精子率、顶体完整率、存活时间等。

1 射精量

可直接用注射器吸取测量，测量时将针头尖部磨平，以使集精杯中的精液全部吸入注射器内，排出气泡，读取数值即可。也可以采用称重法测量射精量。

2 活力

可分目测法和仪器测定法两种。

2.1 目测法

用200～600倍的光学显微镜，观察视野中直线运动的精子数占总精子数的百分比。例如视野中有60%的精子直线运动，即活力为0.6，其它依此类推。肉眼目测活力存在一定的误差，但是只要人员相对固定、测定数量较多形成经验后，准确性会明显提高。并且目测法具有测定速度较快，比较适合人工授精现场操作和大批量生产冻精的要求。为确保测定的准确性，可以定期将目测结果与仪器测定结果进行比对。

2.2 仪器测量法

精液样品制成平板压片，即在载玻片上滴一滴精液，盖上载玻片即可，放在37～38℃显微镜恒温载物台上或有保温箱的显微镜下观察。可用平板压片法在200～400倍恒温显微镜下观察精子的运动状态，然后进行统计。

3 密度

3.1 目测法

在300～600倍显微镜下进行观察，分为密、中、稀三个等级。密，视野中精子很多，精子间的空隙不足容纳一个精子，很难看出单个精子的活动情况；中，视野中精子间有容纳1～2个精子的空隙；稀，视野中精子之间的空隙超过两个精子以上。

3.2 计数板计数法

工具为红细胞计数计，由吸管、软橡胶连管、计数室、盖玻片等组成。因为原精中精子密度很高，不便计数，因而取少量精液稀释若干倍，再放入一定容积的计数室内进行查数，最后换算成1 mL精液中含有的精子数。应用红细胞吸管取精液至0.5(稀释200倍)或1.0(稀释100倍)刻度，再吸取3%氯化钠溶液至101刻度，以拇指和食指分别按住吸管两端，振荡，使精液与3%氯化钠溶液充分混匀，弃去数滴，吸管尖端放在计数板和盖玻片之间的空隙边缘使稀释的精液流入计算室，进行计数。计数板上的两个计数室被划成25个大方格，内由400个小方格组成，25个大方格的面积为1 mm×1 mm=1 mm2，计算5个大方格内的精子数，即可计算出1 mL精液中含有的精子数。为了计算具有代表性，可以选择四角四个大方格及中央的一个大方格或者处于对角线上的5个大方格。计算室的划分情况如图1。

图1 计算室划分情况

5个大方格中的精子数×5等于计算室内25个大方格中的精子数，再乘10则换算成1立方毫米容积内的精子数，再乘1000，则换算为1 mL精液中含有的精子数，因为总的稀释倍数为200倍，所以1 mL原精中含有的精子数为上数乘积再乘200，即原精密度=0.1亿×5个大方格中的精子数。

3.3 精子密度仪测定法

主要根据不同精子密度的透光性原理，取少量精液进行比色分析，操作按仪器说明书进行即可，一般在2 min左右即可测定完成一只公羊的精子密度，主要用于冻精生产及实验室精子密度的测定。

4 存活时间

精子存活时间是指在一定条件下的总生存时间。方法为每1～2 h观察精子的活动状态，直至精子全部死亡，记录精子存活时间。存活时间越长，精子的受精能力越强，反之越差。

5 存活指数

精子存活指数是指精液内精子平均存活时间，即精液内精子活力下降的速度。具体方法是由第1次检查时间到倒数第2次检查之间的间隔时间，加上最后一次与倒数第2次时间的一半，其总和时间即为精子存活时间。每相邻前后两次检查的精子平均活率与其间隔时间的乘积相加的总和即为精子存活指数。精子存活指数越长，精子的受精能力越强，反之越差。

6 精子畸形率和顶体完整率

畸形精子的检查，可在计数死活精子数的同时进行，也可将精液制成抹片直接在显微镜下观察，或用普通染色液(美蓝)或红蓝墨水染色，水洗干燥后镜检。检查的精子数不得少于200个，计算畸形百分比，即畸形率。

精子畸形包括：单身双头精子、单头双身精子、尾部折断精子、尾部弯曲精子、无头精子、无身精子、顶体脱落精子、顶体破裂精子、顶体膨大精子、有原生质滴精子、小头精子等。精子顶体完整率与畸形率的具体测定方法如下：

用精子快速染色液染色，取少量稀释精液抹片，用95%乙醇铺满载玻片固定2～3 min，空气中自然晾干，干透后水合1～2 min，倒净液体。滴加试剂一(细胞核染液)铺满载玻片染色30 s～2 min，流水洗净倒净液体。试剂二(细胞质染液)铺满载玻片染色20 s～2 min，不要倒丢，立即滴加若干滴增色液混合作用5 s左右，再用试剂三(增色液)充分冲洗一遍，滤纸吸干。利用精子分析仪分析。在上述200个精子中标记出畸形精子(畸形精子是指头、体、尾的形态变异，头部畸形有巨大头、无定形、双头等；体部畸形有体部粗大、折裂、不完整等；尾部畸形有卷尾、双尾、缺尾等。)

畸形率=(畸形精子数/200)*100%

随机选取200个精子，观察顶体，标记顶体不完整的精子。由于顶体在受精过程中具有重要作用，因此只有呈直线前进运动并具有完整顶体的精子才具有正常的受精能力。常规检查方法：先同畸形精子检查一样制成抹片，待自然干燥后再在固定液中固定片刻，水洗后用姬姆萨缓冲液染色1.5～2.0 h，再水洗干燥后，用树脂封装，置于1 000倍以上显微镜或相差显微镜下观察200个以上个精子，计算异常率。凡是含有卵黄、甘油成分稀释液的精液抹片，必须先要在含有甲醛的柠檬酸盐液中固定，然后在37℃下干燥后，才能染色和镜检。顶体完整率=(200-顶体不完整精子数/200)*100%

7 精子抗力的测定

抗力测定是用1%氯化钠溶液来进行，因该溶液对精子有一定破坏作用，并随量的增加而增强，精子如能经受较多的溶液则抗力较强。

方法：测定抗力时保持周围温度在18～25℃，用吸管吸取0.02 mL原精液放在玻璃瓶内，然后由滴定管滴入消过毒的1%氯化钠溶液10 mL，轻轻摇动。用玻璃棒取出一滴来镜检。如发现仍有前进运动的精子，可再滴入10 mL 1%的氯化钠溶液，直到精子完全停止前进运动为止。整个测定时间不能超过15 min，最后按下列公式求出抗力指数：抗力=加入的1%氯化钠溶液总量/0.02 mL原精液。

8 精液pH

取一滴精液滴于pH 6.6～8.0的精密试纸上测定，也可用pH电测定仪作更正确的测定。

9 渗透压

是指用半透膜把两种不同浓度的溶液隔开时发生渗透现象，到达平衡时半透膜两侧溶液产生的位能差。渗透压可以用气压、冰点下降度(△)或者渗透克分子浓度等来表示。溶液渗透压的大小取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目：溶质微粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引力越大，溶液渗透压越高；反过来，溶质微粒越少，渗透压越小。与无机盐、蛋白质的含量有关。测量精液的渗透压可用渗透压仪或渗透压计等进行测量。

10 精子质膜完整率

将稀释精液摇匀后取中层精液25 μL的稀释精液于200 μL Host低渗溶液中，37℃水浴孵育30 min，取少量液体制作抹片，待其干燥后在显微镜下检测精子弯尾率。在显微镜下随机选取200个精子进行观察分析，计算精子弯尾率。

质膜完整率=(弯尾精子数/200)×100%

在上述各技术检测指标中，人工授精经常使用的为射精量、密度、活力、存活时间、畸形率指标，其它指标主要供试验室对精子进行具体分析。

11 参考文献

[1] 杨术环等.辽宁绒山羊人工授精操作规程.DB21/T2434-2015.

[2] 张世伟等.辽宁绒山羊生实用技术[M].内蒙古人民出版社，2003，06.

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[4] 刘兴伟.辽宁绒山羊人工授精技术[J].黑龙江动物繁殖，2010,18(1):28-31.

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[6] 刘兴伟,等.提高细管冻精质量的技术措施[J].吉林畜牧兽医,2009,30(5):44.

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