甲状腺乳头状癌组织中CK34βE12、MC的表达和BRAF基因突变的意义

侯卫华，李从洋，孟祥超，于兵兵，刘艳峰，张 萌，王建业，段尚林，胡学信(中国人民解放军第152中心医院病理科，河南 平顶山 467000)

甲状腺乳头状癌组织中CK34βE12、MC的表达和BRAF基因突变的意义

侯卫华，李从洋，孟祥超，于兵兵，刘艳峰，张 萌，王建业，段尚林，胡学信
(中国人民解放军第152中心医院病理科，河南 平顶山 467000)

目的探讨高分子量角蛋白CK34βE12、间皮细胞(MC)表达和BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌(PTC)中的临床意义。方法采用免疫组化Envision两步法检测88例PTC和88例甲状腺良性病变(BTL)中CK34βE12、MC的表达；采用PCR及DNA测序法检测36例PTC和36例BTL中BRAF基因突变状况，分析其与PTC临床病理特征的关系。结果88例PTC组织中CK34βE12、MC阳性率分别为96.6%、95.5%，高于BTL组织中的13.6%、6.8%(P<0.05)。CK34βE12、MC在PTC组织中表达的敏感性分别为96.6%、95.5%，特异性分别为86.4%、93.2%。36例PTC组织中BRAF突变率为63.9%，高于BTL组织中的0.0%(P<0.05)。BRAF突变与肿瘤淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论检测CK34βE12、MC在PTC与BTL鉴别诊断中具有重要实用价值；BRAF突变对确诊PTC具有重要临床意义，且可能是预测PTC侵袭转移能力的指标。

甲状腺肿瘤；乳头状癌；免疫组化；高分子角蛋白；间皮细胞；BRAF基因

甲状腺乳头状癌(papilary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤,病理诊断主要依据典型的细胞核特征及复杂的乳头状结构，而有时一些甲状腺良性病变(benign thyroid lesions，BTL)亦可呈乳头状或假乳头状增生，当细胞核的特征不典型时鉴别诊断常会存在一定困难；包裹性滤泡型乳头状癌当细胞核的特征不明显时与滤泡性腺瘤鉴别更有一定难度，因此，借助有效的免疫标志物及分子检测对其确诊将有重要临床意义。本研究旨在通过检测PTC组织中高分子量角蛋白CK34βE12、间皮细胞(mesothelial cell，MC)的表达和BRAF基因突变的状况，探讨这些指标在PTC和BTL鉴别诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2012年1月至2016年6月中国人民解放军第152中心医院病理科甲状腺手术存档标本176例，其中PTC 88例、BTL 88例。88例PTC患者年龄19～70岁，中位年龄42岁，<40岁者36例，≥40岁者52例；男23例，女65例。PTC单发癌结节46例，多发癌结节42例；结节直径<1 cm者35例，≥1 cm者53例。29例合并中央区和(或)颈部淋巴结转移癌，59例无淋巴结转移癌。88例BTL多取自上述标本的癌旁BTL或健侧叶BTL组织(结节性甲状腺肿48例，桥本氏甲状腺炎20例)及滤泡性腺瘤20例，患者年龄22～71岁，中位年龄47岁；男23例，女65例。对其中2015年1月至2016年6月的PTC和BTL各36例存档蜡块进行BRAF基因检测。36例PTC患者中位年龄45(21～69)岁，其中<40岁者16例，≥40岁者20例；男12例，女24例；PTC单发癌结节19例，多发癌结节17例；结节直径<1 cm者14例，≥1 cm者22例；14例合并中央区和(或)颈部淋巴结转移癌，22例无淋巴结转移癌。36例BTL患者年龄20～69岁，中位年龄44岁；男10例，女28例。

1.2主要试剂与设备免疫组化所用一抗[CK34βE12(34βE12)、MC(HBME-1)]和Envision检测试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司。DNA提取试剂盒和BRAF基因(DNA测序法)检测试剂盒购于北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司。检测设备采用ABI 3130 DNA测序仪及ABI 7500荧光定量PCR仪。

1.3方法免疫组化法：所有标本均经质量分数4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚3 μm，免疫组化采用Envision二步法，按说明书步骤进行操作，使用阳性对照片作阳性对照，TBS液代替一抗作阴性对照，研究标本与对照片进行同步染色。结果判断：CK34βE12阳性位于细胞质，MC位于细胞膜。阳性是指细胞质或细胞膜上呈浅黄色至棕褐色。综合判断染色强度评分和高倍镜下阳性细胞百分比评分。按染色强度评分：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。按阳性细胞百分比评分：显微镜下随机取5个高倍视野，计算阳性细胞的平均百分比，≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。计算染色强度得分和阳性细胞百分比得分之和，其中0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

PCR和DNA测序法：镜下选取富含肿瘤成分的石蜡包埋组织块，每例组织块连续切6张10 μm厚的组织片，直接封装于EP管中，二甲苯脱蜡、蛋白酶消化，按DNA提取试剂盒要求提取样本DNA，将待测样本、BRAF阴性及阳性质控品依次加样，完成配置反应体系，应用PCR对样本DNA-BRAF基因的第15外显子进行扩增，然后置于全自动基因分析仪内进行测序。结果分析采用Chromas软件，清除不稳定序列后，与野生型序列比较，600(T1799A)位密码子GTG变成GAG( T→A)时为突变，即密码子600的错义突变(V600E)。

1.4统计学处理采用SPSS 22.0对数据进行分析，率的比较用χ2检验(必要时连续校正)或Fisher确切概率法，同时按照临床流行病学诊断试验研究评价计算方法，计算不同免疫标志物敏感性和特异性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1CK34βE12、MC的表达CK34βE12、MC在PTC组织中的阳性率分别为96.6%、95.5%，两者均以中等强度至强阳性为主，而在BTL组织中的阳性率分别为13.6%、6.8%，主要为弱阳性，差异均有统计学意义(P均<0.05)。CK34βE12、MC在PTC组织中的表达分别与结节性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、滤泡性腺瘤比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。PTC组织中CK34βE12、MC的阳性表达与患者的性别、年龄、结节直径、结节数目及淋巴结有无转移无关(P均>0.05)。见图1,表1、2。

图1 PTC组织中CK34βE12(A,×200)和MC(B,×400)的表达

表1 PTC和BTL组织中CK34βE12、MC的表达

注：表中统计量为各标本与PTC比较的统计量

表2 CK34βE12、MC的表达与PTC临床病理参数的关系

2.2CK34βE12、MC表达的敏感性和特异性CK34βE12和MC在PTC中表达的敏感性分别为96.6%(85/88)、95.5%(84/88)，特异性分别为86.4%(76/88)、93.2%(82/88)。

2.3PTC和BTL组织中BRAF(V600E)突变情况PTC组织中63.9%(23/36)的病例第15外显子的第1 799位点存在T→突变，全部为杂合性突变，而BTL无一例发生突变，突变率为0.0%，差异有统计学意义(P<0.05)。PTC组织中BRAF突变与有无淋巴结癌转移有关(P<0.05)，而与患者的性别、年龄、结节数目和直径无关(P均>0.05)。见表3。

表3 BRAF基因突变与PTC临床病理参数的关系

3 讨论

单克隆抗体CK34βE12是一组包括角蛋白1、5、10和14的中间丝结构蛋白，相对分子质量为40 000～68 000，是上皮细胞的主要细胞骨架成分，这些中间丝被当作张力丝通过桥粒与相邻细胞固定在一起，使得上皮具有伸展性和稳定性。甲醛溶液固定石蜡包埋组织的免疫反应，需要抗原修复，阳性定位于细胞质。国外文献[1-2]报道，CK34βE12在PTC组织中呈强阳性表达，有助于鉴别PTC和甲状腺腺瘤等，且在BTL组织中不表达或灶性弱表达。Liberman等[3]报道CK34βE12表达于91%的PTC，并将其解释为CK1上的抗原决定簇的存在，或是存在一种不能被CK5、CK10、CK14抗体所识别的抗原决定簇。我们的研究结果显示CK34βE12在PTC组织中的阳性率96.6%，而在BTL组织为13.6%，差异有统计学意义，具有较高敏感性和特异性，可作为甲状腺良、恶性病变鉴别诊断中的参考指标。

MC是间皮细胞表面的一种酸性多聚糖蛋白，主要为透明质酸，最初发现其主要表达于间皮源性肿瘤，随着对其用途研究的深入，近年来国内外文献[4-7]均有将其用于甲状腺良、恶性疾病鉴别诊断的报道。MC阳性染色主要定位于细胞膜，在PTC中以中等强度至强阳性为主，阳性率为98.9%，而在BTL中主要为弱阳性，阳性率为6.8%。研究结果证实MC在PTC组织中阳性率明显高于BTL，且具有较高敏感性和特异性，对于PTC和BTL鉴别诊断具有重要参考价值。

BRAF是RAF基因家族中的癌基因之一，编码丝/苏氨酸的一种特异性激酶，参与调控细胞增殖分化和凋亡。BRAF基因位于7p34，编码783氨基酸的蛋白，相对分子质量为94 000～95 000。近年来发现结直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌及恶性黑色素瘤等多种恶性肿瘤均可存在BRAF基因突变。研究[8-11]认为，在PTC及合并PTC的甲状腺未分化癌中，BRAF突变与PTC的发生、发展有密切关系，因此，有学者认为未分化癌是PTC发生去分化而来。BRAF突变主要发生于第15外显子的第1 799位点上，此处的腺嘌呤变成胸腺嘧啶(T1799A)，导致编码的第600位氨基酸由谷氨酸被缬氨酸(V600E)替代，致BRAF激酶活性增强，V600E突变模拟T598和S601磷酸化作用，导致BRAF蛋白活化，从而促使甲状腺细胞不断增殖形成肿瘤。本研究结果显示，PTC组织中BRAF突变率为63.9%，而在BTL中均未检测到BRAF突变，与文献[4,9-12]研究结果相同，因此，可以确定BRAF突变是PTC的重要遗传学事件，对PTC的确诊亦有着重要意义。在本研究中BRAF突变与PTC局部侵袭能力及淋巴结转移显著相关，因此，BRAF突变是PTC预后差的重要提示因素[10-14]。

综上所述，PTC组织中CK34βE12、MC弥漫表达，以及BRAF突变可作PTC和BTL鉴别诊断的重要辅助手段，BRAF突变还可作为评价PTC生物学行为的重要指标。当遇见不典型病例或鉴别诊断有困难时，检测上述指标具有重要参考价值，有助提高正确诊断率。

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SignificanceofCK34βE12,MCExpressionandBRAFGeneMutationinthePapilaryThyroidCarcinoma

HOU Weihua,LI Congyang,MENG Xiangchao,YU Bingbing,LIU Yanfeng,ZHANG Meng, WANG Jianye,DUAN Shanglin,HU Xuexin
(DepartmentofPathology,the152HospitalofPLA,Pingdingshan467000,China)

ObjectiveTo explore the significance of CK34βE12,mesothelial cell (MC) expressions and BRAF gene mutation in the papilary thyroid carcinoma.MethodsThe expressions of CK34βE12 and MC protein in the 88 cases of PTC tissues and the 88 cases of benign thyroid lesions (BTL) were detected by immunohistochemical Envi sion method; The mutation status of BRAF protein in the 36 cases of PTC tissues and the 36 cases of BTL tissues were detected by PCR and DNA sequencing,the relationship between them and the clinical pathological characteristics were analyzed.ResultsThe positive rate of CK34βE12 and MC in the PTC was respectively 96.6% and 95.5%,and was respectively 13.6% and 6.8% in the BTL,the difference was statistically significant (P<0.05).The sensitivity of MC and CK34βE12 in the PTC was 96.6% and 95.5% respectively,and the specificity was 86.4% and 93.2% respectively.The BRAF mutation rate in the PTC was 63.9%,and was 0.0% in the BTL,the difference was statistically significant (P<0.05).The BRAF mutation was closely related with lymph node metastasis (P<0.05).ConclusionThe detection of CK34βE12 and MC has the important practical value in the differential diagnosis of PTC and BTL; the BRAF mutations has the important clinical significance in the diagnosis of PTC,and may be a index to forecast invasion and metastasis in the PTC.

thyroid neoplasms; papillary carcinoma; immunohistochemistry; high molecular weight keratin; mesothelial cell; BRAF gene

侯卫华(1979-)，男，主治医师，主要从事肿瘤病理研究。E-mail：hou.wh@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.004

R736.1;R730.23

A

1673-5412(2017)05-0377-05

2016-12-01)