外泌体与肿瘤干细胞动态平衡*

孙振, 董立华, 王修杰

610021 成都 四川大学华西医院 实验肿瘤研究室(孙振、董立华、王修杰)；610021 成都 四川大学华西基础医学与法医学院 人体解剖学教研室(董立华)

•综述•

外泌体与肿瘤干细胞动态平衡*

孙振, 董立华, 王修杰△

610021 成都 四川大学华西医院 实验肿瘤研究室(孙振、董立华、王修杰)；610021 成都 四川大学华西基础医学与法医学院 人体解剖学教研室(董立华)

外泌体是直径为30～100 nm，表达特异性表面分子，如CD63、CD81等的胞外囊泡，其内包有DNA、mRNA、ncRNAs、蛋白以及脂类等生物活性物质。通过转运其包含物，外泌体可调控受体细胞的信号通路及蛋白表达，在介导肿瘤细胞与其肿瘤微环境中其他细胞间的细胞通讯和物质交流中起重要作用。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织内，具有自我更新和分化潜能的细胞亚群，被认为是导致肿瘤传统治疗失败和复发的根源。然而，肿瘤干细胞与非干性肿瘤细胞之间实则处于分化和去分化的动态平衡状态，肿瘤干细胞不再是肿瘤治疗的固定靶点，因此，阻断其相互转化尤为重要，更是较好的肿瘤治疗策略。外泌体作为细胞间信息传递的载体，是否参与调控肿瘤干细胞与非干性肿瘤细胞之间的相互转化，靶向外泌体及其信号通路是否有利于减少肿瘤干细胞的生成，最终根治肿瘤，值得深入研究。

外泌体；肿瘤干细胞；动态平衡；肿瘤微环境；靶向治疗

外泌体是起源于核内体(endosomes)、大小为30～100 nm的囊泡，几乎所有细胞都释放外泌体或胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，并存在于所有体液中。外泌体作为细胞间物质交换的载体，介导细胞-细胞间通讯，参与机体各种生理及病理过程。异质性是恶性肿瘤的重要特征，肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织内存在一类具有自我更新和分化潜能的细胞亚群，CSCs的存在是导致传统治疗失败及发肿瘤复发的根本原因。然而，CSCs并非是稳定的、静止不变的实体细胞群，在特定的微环境下，一些已分化、失去干细胞特性的肿瘤细胞(non-CSCs)可通过去分化或重编程等重新获得干性表型，CSCs与non-CSCs处于分化和去分化的动态平衡状态[1]，CSCs与肿瘤细胞及其肿瘤微环境中其他细胞间的细胞通讯和物质交流对维持其动态平衡至关重要。外泌体作为载体，在介导肿瘤细胞与其肿瘤微环境中其他细胞间的细胞通讯和物质交流中起重要作用；通过转运肿瘤相关mRNA、miRNA、蛋白等调控肿瘤的生长、转移、耐药、血管生成以及免疫逃逸等过程。外泌体作为信息载体，是否参与non-CSCs与CSCs之间相互转化及维持肿瘤干细胞动态平衡及作用机制，是否可以靶向外泌体及其信号通路从而清除肿瘤干细胞，根治肿瘤值得深入研究。为此，本文将对外泌体的生物发生过程及其内容物、肿瘤干细胞、肿瘤干细胞动态平衡及其影响因素、外泌体在维持肿瘤干细胞表型中的作用、靶向外泌体与肿瘤治疗等研究进展作一简要综述，以期为相关研究提供参考。

1 外泌体的生物发生

1.1 外泌体的发生与内容物分选

外泌体(exosome)这一术语是Trams等[2]在20世纪80年代初第一次提出的。他们将在电镜下观察到的直径在40 nm和500～1000 nm且携带有5'核苷酸酶活性的两种类型的囊泡称为外泌体(exosomes)，并提出这些囊泡可能具有生理学功能。随后研究揭示了外泌体的内体起源[3]，并能够携带多种信号分子[4-6]，研究结果提示外泌体可能是细胞间通讯中的重要介质，由此引发了对外泌体的研究兴趣。随着其研究的不断深入，对外泌体的生物发生过程有了初步认识。

外泌体的生物发生是一个严密有序的过程，其中涉及到多种细胞调控机制。首先，细胞通过内吞作用将胞外配体或细胞组分内化形成早期内体，早期内体在成熟的过程中，通过向内出芽形成管腔内囊泡(intraluminal vesicles, ILVs)，并选择性的将蛋白、核酸、脂质等物质包裹其内，这一过程使早期内体转变成多泡内体或多泡体(multivesicular bodies, MVBs)[7]。形成的多泡体一部分与溶酶体融合而被降解，为细胞提供能量物质和结构分子；另一部分通过高尔基体再循环或通过细胞分泌而被释放到胞外[5]。

外泌体内容物可通过多种机制选择性的被分选进入ILVs。内体蛋白分选转运装置(ESCRT)能选择性的将泛素化蛋白分选进入ILVs，这一过程需要ESCRT-0, -I, -II and -III以及VPS4、VTA1、ALIX/PDCD6IP及TSG101等的参与[8]。脂类如神经酰胺、胆固醇，和四跨膜蛋白超家族,如CD9、CD63和CD81也被发现能介导外泌体蛋白的分选[9]。外泌体mRNA的分选可能由其3′-UTR的Z拉链结构介导，而miRNA则可通过与RISCs组成复合物而被分选进入MVBs[10-11]。

1.2 外泌体的释放与摄取

MVBs形成后，将向质膜边缘转移，并与质膜(PM)融合将外泌体释放到细胞外。这一过程需要细胞骨架蛋白(肌动蛋白和微管)、相关的分子马达(驱动蛋白和肌球蛋白)、分子开关(小GTP酶)和融合机器(SNAREs)等的参与。Rab蛋白通过与细胞骨架的相互作用参与囊泡的出芽与转移，负责介导MVBs向质膜转运[8]，且不同类型的细胞中有不同的Rab蛋白亚型参与介导MVBs向质膜边缘的转移[12-14]。SNARE蛋白能在两膜之间与SNAPs形成复合物并介导两个细胞器之间的膜融合，SNARE蛋白能够促进MVBs与质膜的融合[15]。

分泌到胞外的外泌体可被受体细胞通过多种途径摄取。首先，外泌体通过特异的表面受体绑定到受体细胞表面[16-17]；然后，被受体细胞通过内吞作用、胞饮或吞噬作用以及质膜融合等途内化[18-19]，从而将内含物释放到受体细胞胞质中，发挥其生物学功能。

2 外泌体的内容物与功能

活细胞分泌的外泌体包含多种生物活性物质，现已发现9769种蛋白、2838种miRNA以及1116种脂类物质(ExoCarta数据库)。外泌体所携带的内含物高度可变，取决于起源细胞但又与之有别。更重要的是，外泌体可将这些生物活性物质转运到邻近或远端细胞中，发挥其相应的生物学功能，从而改变受体细胞的生物学行为。

2.1 蛋白

由于外泌体起源于内体，一些内体相关蛋白普遍存在于外泌体中，包括膜转运与融合相关蛋白：Rab-GTP酶、膜联蛋白(Annexin)，热休克蛋白(HSPs), 包括Hsp60、Hsp70和 Hsp90，四跨膜交联蛋白(Tetraspanins)，包括CD9、CD63、CD81、CD82，以及MVBs相关蛋白, Alix 和TSG101(广泛用于外泌体的鉴定[4, 20]。肿瘤细胞来源的外泌体还携带有与肿瘤细胞相关的特异性蛋白。胶质瘤细胞(GBMs)释放的外泌体中富含细胞因子，如VEGF-A、Semaphorin3A以及TGFβ[21]；GBM以及肺癌细胞来源的外泌体中发现有EGFRvIII存在[22]；鼻咽癌细胞来源的外泌体中高表达HIF1α(与肿瘤细胞的增殖、迁移及血管生成有关)，促进受体细胞迁移[23]；纤维肉瘤和黑色素瘤细胞来源的外泌体中含有MT1-MMP，能激活受体细胞中的MMP2，从而改变受体细胞的胞外基质[24]。还有研究发现，卵巢癌细胞来源外泌体中包含有FasL和TRAIL，能诱导树突细胞(DCs)和外周血单个核细胞(PBMCs)发生凋亡，从而引起免疫抑制，促进肿瘤发展[25]。有趣的是，外泌体中还含有细胞信号通路相关蛋白质, 如Wnt蛋白[26-27]、Notch配体DLL4[28]，以及介导细胞间通讯的蛋白，如白介素[29]。这些蛋白在肿瘤发展、维持以及耐药等方面发挥重要作用。

2.2 核酸

随着高通量测序等新一代技术在生物学中的应用，大量的遗传物质被发现存在于外泌体中。研究发现，外泌体中富含一些小非编码RNA(包括miRNA、snRNAs、snoRNAs)[30]，也包含有特异的mRNA，但只含有极低水平的或无法检测到的18s和28s RNA[6]。在EVs中甚至还发现线粒体DNA以及小片段的DNA序列[31-32]。

miRNA是一类长度在20～25 nt的小非编码RNA，通过靶向mRNA序列，从而参与基因的转录后调控。研究发现，miRNA分选进外泌体的过程并不是随机的，外泌体中的miRNA的种类和表达水平与其起源细胞相关，但又与之有所不同。Guduric-Fuchs等[33]通过分析各种不同细胞系及其释放的外泌体中miRNA的表达水平，发现一些miRNA(如，miR-150、miR-142-3p、 miR-451等)被优先分选到外泌体中；Ohshima等[34]也发现let-7 miRNA家族大量存在与胃癌细胞系AZ-P7a来源的外泌体中，而在其它肿瘤细胞的外泌体中的表达水平较低。在肿瘤细胞来源的外泌体中发现含有肿瘤细胞特异性的miRNA。转移性乳腺癌细胞的外泌体中富含与miR-200s，并能增强非转移性的肿瘤细胞的转移能力[35]；GBM来源的EVs中富含多种致瘤性miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、 miR-221和miR-451，通过转运这些miRNA，GBM-EVs可改变其微环境中的非恶性细胞的表型，并促进肿瘤发展。然而，在肿瘤细胞的外泌体中也发现了肿瘤抑制性miRNA，如，促进凋亡和衰老的miR-34 被发现存在于乳腺癌、前列腺癌、脑瘤及膀胱癌细胞释放的外泌体中[36-37]。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式参与染色体修饰、基因的转录、mRNA的翻译以及蛋白功能的调控[38]。Gezer等[39]在HeLa和 MCF-7细胞及其分泌的外泌体中鉴定出MALAT1，HOTAIR，lincRNA-p21，GAS5，TUG1和CCND1-ncRNA 6种LncRNA，并发现这6种LncRNA在细胞核其外泌体中的表达水平存在差异。Kogure等[40]也在肝癌细胞的外泌体中发现一个新的超保守的LncRNA(ucRNA)TUC339。此外，有miRNA海绵作用的环状RNA(circRNA)也在肿瘤细胞的外泌体中被发现，且外泌体中的表达水平远高于来源细胞的[41]。

外泌体所携带的mRNA远没有其所携带的miRNA丰富，且其在外泌体中的表达水平与来源细胞的也有所不同。研究发现外泌体携带的mRNA在受体细胞内翻译成蛋白，发挥其功能[42]。

2.3 脂类

与蛋白、核酸相比，对外泌体的脂质组成研究较少。一般来说, EVs(包括外泌体)的脂质成分与起源细胞有共同的特征。但一些研究也发现，不同类型的胞外囊泡含有一些特异性的脂类，外泌体中富含鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇以及饱和脂肪酸[43]。另外还发现，神经节苷脂GM3和神经酰胺及其衍生物也在外泌体中富集[44]。其中鞘磷脂、胆固醇以及GM3能够增强外泌体膜的刚性及稳定性[45]。然而，存在于ILVs中的LBPA却不在外泌体中富集。Huarte等[38]发现骨髓间充质干细胞来源的EVs中甘油二酯(diacyl-glycerol)和鞘磷脂(sphingomyelin)的含量较高，而神经酰胺的含量则相对较低。外泌体的脂类及脂代谢相关的酶被发现参与外泌体的发生与释放过程以及内容物的分选。Trajokovic等[46]发现通过抑制剂或siRNA抑制中性鞘磷脂酶(nSMase)的活性后，能够减少外泌体的释放。Phuyal等[47]发现增加前列腺癌细胞中醚脂(Ether lipids)水平不仅能促进外泌体的分泌，同时还改变了外泌体的脂类和蛋白组分。

外泌体所携带的内容物与其来源细胞在种类和表达水平上都存在差异，这表明外泌体内容物是有选择性的被分选进入ILVs中的。

3 肿瘤干细胞及可塑性

3.1 肿瘤干细胞模型

大量实验研究表明，肿瘤组织是有各种异质性的肿瘤细胞组成的，其中存在着一小群具有干细胞特性的肿瘤细胞，即CSCs或肿瘤起始细胞(cancer initiating cells,CICs)。因具有自我更新能力和多向分化潜能，且对放化疗耐受等特性，肿瘤干细胞被认为是肿瘤生长、发展以及复发的根本原因。 支持肿瘤干细胞存在的最早证据是源自于对恶性白血病的研究。Shimada等[48]在研究鼠的原发性淋巴瘤细胞时，发现移植的淋巴瘤细胞中有一小群细胞具有干细胞性质，能够在受体小鼠的脾脏上形成集落的亚细胞群。随后，Hamburger等[49]和Bonnet等[50]也通过软琼脂克隆的方法也证实鼠或人的原发性肿瘤组织中有一小部分癌细胞具有无限增殖能力，其研究结果证实了具有自我更新能力的恶性白血病细胞的存在，为肿瘤干细胞假说提供了直接的证据。随后，研究者通过免疫荧光技术和流式细胞术成功的从急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)组织中分离CD34+CD38-[51]和CD90-[52]表型的白血病细胞，发现只有此细胞亚群能够在NOD/SCID小鼠体内形成AML。Al-Hajj等[53]采用相同的方法，从乳腺癌组织中分离得到了CD44+CD24-/lowLineage-的癌细胞，并发现此亚群细胞在NOD/SCID小鼠中可持续地形成肿瘤，并有很强的致瘤性。而其余的肿瘤细胞即使注射数倍数量的细胞也未能形成肿瘤。此外，通过利用表面分子(CD133、CD44)[54-55]侧群分分选和肿瘤球形成分析[56]，研究者成功地从人胶质瘤组织中分离并鉴定出肿瘤干细胞。随后，在一系列的实体瘤中也都发现了肿瘤干细胞的存在[57-58]。

肿瘤干细胞假说认为，肿瘤干细胞是肿瘤组织中唯一具有起始肿瘤、促进肿瘤生长的一小群细胞。在过去几十年间，肿瘤干细胞在血液癌及实体瘤中被陆续发现，肿瘤干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，并对放化疗具有耐受性。肿瘤干细胞的干性特性被认为是导致肿瘤传统治疗失败及肿瘤复发的根本原因。因此，靶向肿瘤干细胞可能是有效的根治肿瘤的新方法。

3.2 肿瘤干细胞的可塑性

肿瘤干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，分化产生多种具有有限增殖能力的肿瘤细胞亚群，由此可区分或鉴定肿瘤干细胞。然而，最近研究发现，肿瘤干细胞分化成非干性的肿瘤细胞(non-CSCs)可能并非像之前认识的那样总是单向不可逆的过程，相反，肿瘤干细胞表型具有可塑性，一些已分化的肿瘤细胞可从非干细胞状态转化到干细胞状态，非肿瘤干细胞亚群细胞也可转化为肿瘤干细胞[59-60]。Vermeulen等[61]研究发现，从结肠癌中分离的非肿瘤起始细胞在与成纤维细胞共培养后，重新表达CSC标志物，并恢复了致瘤能力，这表明，肿瘤细胞的干性并非是固定不可变的，而是可被调控的。Roesch等[62]发现，即使是单一的JARID1B-黑色素瘤细胞也能产生包括JARID1B+细胞(具有肿瘤干细胞特性)在内的多种异质的子代细胞。在胶质瘤的研究中也发现，经替莫唑胺处理的非干性GBM 细胞可去分化而获得干细胞表型和潜能[63]。在其他类型的肿瘤中，也证实了已分化的、失去成瘤能力的肿瘤细胞可通过各种途径重新获得干细胞样表型[64-65]。

上述发现提示，肿瘤干细胞可能并非是静止不变的细胞群，而是处于动态变化的群体。一方面肿瘤干细胞不断的自我更新和分化产生非干性的肿瘤细胞，另一方面已分化的肿瘤细胞又不断的去分化，获得干性成为肿瘤干细胞，以维持肿瘤内干细胞的动态平衡和肿瘤生长复发。目前，对于肿瘤干细胞这种动态平衡的调控机制尚不清楚，但有研究发现，一些因素可诱导非干性的肿瘤细胞向干细胞转化。

3.3 CSC可塑性的影响因素

3.3.1 肿瘤干细胞微环境 正常干细胞(NSC)需要依赖特殊的干细胞微环境(stem cell niche)来维持其干细胞特性，如自我更新和多向分化潜能[66-67]。类似的，肿瘤干细胞也需要同样的特殊微环境—肿瘤干细胞微环境(CSC niche)来维持其自我更新与分化之间的平衡[68]。肿瘤干细胞与其微环境间的分子串话在维持其干细胞表型与功能中发挥着重要的作用。间充质干细胞(MSCs)是肿瘤干细胞微环境重要组成部分之一，可分泌多种细胞因子，为肿瘤干细胞的产生提供有利的微环境。乳腺癌干细胞通过分泌IL-6，招募间充质干细胞，并诱导其产生CXCL7细胞因子，以支持肿瘤干细胞表型[69]，且IL-6还能诱导已分化的肿瘤细胞向肿瘤干细胞表型转化[70]；MSCs还可通过与乳腺癌细胞直接接触，上调其miR-199a的表达水平，引起一系列相关microRNA的异常表达，并抑制FOXP2的表达，从而提高肿瘤细胞的干细胞特性[71]。肿瘤干细胞与内皮细胞之间的相互作用对肿瘤干细胞表型的维持与其功能的发挥也是至关重要的。肿瘤微环境中的内皮细胞可通过与肿瘤细胞的直接相互作用或释放细胞因子来调控肿瘤干细胞的生物学行为[72]；血管内皮细胞能够通过分泌一氧化氮(NO)激活胶质瘤干细胞中NOTCH信号通路，促进肿瘤干细胞的自我更新并抑制其分化[73]。此外，肿瘤相关的成纤维细胞(CAFs)所释放的肝细胞生长因子(HGF[61]和膜联蛋白A1(Annexin A1)[74]能够使已分化的肿瘤细胞重新获得干细胞表型。Mayo等[75]发现CD8+T细胞能够促进乳腺癌细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程，使其获得肿瘤干细胞特性，包括高致瘤性和对放、化疗的耐受性。此外，肿瘤微环境中的缺氧环境也能诱导非干性的肿瘤细胞获得干细胞表型[76-77]。

肿瘤干细胞微环境是肿瘤干细胞增殖、分化和存活不可或缺的因素，肿瘤干细胞与其微环境的相互作用有利于其动态平衡的维持。

3.3.2 EMT及其转录因子 EMT是上皮细胞向间充质细胞转分化的现象，对胚胎发育过程中的组织形态发生至关重要[78-79]。更重要的是，EMT过程的激活与正常和肿瘤细胞的干性的维持密切相关，大量实验研究证实EMT能够诱导肿瘤细胞向肿瘤干细胞转化[80-81]。过表达EMT相关转录因子Snail、Twist或FOXC2不仅使乳腺癌细胞发生表型转化，同时还提高其肿瘤球形成、软琼脂克隆能力和致瘤潜能，并使其获得CD44high/CD24low(乳腺癌CSCs和乳腺上皮干细胞的标志物)抗原表型[82-83]。这表明EMT过程在肿瘤干细胞状态转变的过程中发挥着重要的作用。在肿瘤细胞中研究发现，E-钙粘蛋白的阻遏物ZEB1-上皮-间质转化的一个关键调节因子-能够通过抑制上皮极性来促进浸润性导管癌和乳腺小叶癌的去分化[84]。Chaffer等[64]也证实EMT转录因子ZEB1能够介导非干性的基底样乳腺癌细胞(CD44low)向干细胞状态转化(CD44high)；同时还发现EMT的诱导剂TGF-β也能有效地促进基底样乳腺癌细胞中非干细胞向干细胞转化。此外，Fang等[85]发现另一个EMT转录因子Twist2能够促进乳腺癌干细胞的自我更新能力。过表达Twist2，能够提高乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞的克隆形成能力，促进肿瘤的生长，并增加CD44high/CD24low细胞亚群的数量和干细胞标志物的表达。

此外，一些miRNA[86]及肿瘤微环境中的基质细胞分泌的细胞因子和生长因子[87]也能诱导肿瘤细胞的EMT过程，使分化的肿瘤细胞向肿瘤干细胞转化。

3.3.3 重编程转录因子 重编程转录因子OCT3/4、SOX2、c-Myc、KLF4或OCT4、SOX2、NANOG、LIN28的瞬时表达，可使已分化的细胞重新获取干细胞特性。这些在维持胚胎干细胞(ESCs)的自我更新中起着关键的作用的转录因子，常常在肿瘤组织中高表达，并能诱导肿瘤细胞去分化使之获得干细胞表型。Suva等[88]鉴定出几种与神经发育相关的转录因子(POU3F2、SOX2、SALL2和 OLIG2)，发现过表达其中任一个转录因子都可诱导已分化的GBM细胞重编程为干细胞样的GBM 细胞；Oshima等[89]发现，转染OCT3/4、SOX2和KLF4三种转录因子可增强结肠癌细胞的干性表型；Zbinden等[90]和Jeter等[91]证实过表达转录因子NANOG，能够诱导肿瘤细胞产生肿瘤干细胞样表型和特性，并上调肿瘤干细胞标志物 CXCR4、IGFBP5、CD133和ALDH1的表达水平；而下调NANOG的表达，则抑制肿瘤细胞的自我更新和成瘤能力。还有研究发现，重编程转录因子OCT4和SOX2在未分化的肿瘤干细胞亚群中显著高表达，在肿瘤干细胞干性表型的维持中起到重要作用。过表达OCT4能诱导黑色素瘤细胞去分化，向干细胞样表型转化，获得形成肿瘤球的能力，耐药性、体内成瘤潜能增加[92]；Murakami等[93]也发现过表达OCT4 和SRY能增强肝癌细胞干性表型，而下调OCT4的表达水平则会抑制肿瘤细胞的干细胞特性[94]。在胶质瘤(GBM)的研究中发现，过表达SOX2能够显著增强GBM的干细胞表型[95]，而通过RNAi技术沉默SOX2基因的表达可抑制GBM干细胞的增殖，并使其失去肿瘤启动能力[96-97]。在其他肿瘤中也发现，SOX2能够诱导肿瘤细胞的去分化，并赋予其干细胞样表型[98-99]。

上述研究结果表明，重编程转录因子，能够调节肿瘤干细胞的可塑性，在维持肿瘤干细胞动态平衡中发挥着重要的作用。

4 外泌体在维持肿瘤干细胞表型中的作用

如上所述，已分化、非干性肿瘤细胞与肿瘤干细胞之间能够相互转化，维持了肿瘤干细胞动态平衡。肿瘤细胞、肿瘤干细胞与其微环境间的“物质串话(crosstalk)”是该动态动态平衡的重要场地和物质基础。外泌体作为生物活性物质转运的载体，介导了多种类型的细胞通讯，由此可以推测，外泌体可能通过转运干性相关特异分子调控肿瘤干细胞分化和肿瘤细胞去分化，从而维持肿瘤干细胞动态平衡。具体见表1。

4.1 外泌体介导肿瘤细胞与其微环境间通讯

肿瘤干细胞与肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的基质细胞间的物质交流与信号通讯在肿瘤干细胞动态平衡的维持中至关重要，而胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)的释放与摄取是介导肿瘤细胞间以及肿瘤细胞与其微环境间信息交流的一个重要方式[100]。最新研究发现，肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)释放的外泌体可促进已分化的肿瘤细胞干性表型增强[101]，并能调控肿瘤细胞的存活与增殖[102]。Rodriguez等[103]的研究也发现，干细胞样的乳腺癌细胞释放的外泌体中富含干性及转移相关的mRNA，并能促进受体细胞的致瘤潜能。

4.2 外泌体介导干性通路

Wnt信号通路在生长、发育、代谢和干细胞维持等多种生物学过程中发挥重要作用。Wnt通路的异常激活与肿瘤的发展密切相关[104]，并参与CSC自我更新与分化的调控[105-107]。近期研究发现，外泌体能够介导受体细胞的Wnt通路的调控。在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的研究中也发现，成纤维细胞的外泌体能够激活CRCs的Wnt 信号通路，使其表现出干细胞特性，包括成球和致瘤能力，并增加了CRCs中CSCs所占比例[108]。相似的，人间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源的外泌体也能够通过激活Wnt信号通路促进乳腺癌细胞的增殖[109]。淋巴瘤的侧群细胞分泌的外泌体可转运Wnt3a激活受体细胞中Wnt信号通路，介导侧群细胞与非侧群细胞间的转化[26]；此外，研究还发现，胃癌细胞来源的外泌体可通过PI3K/Akt和MAPK/ERK 信号转导通路促进肿瘤细胞的增殖[110]；基质细胞释放的外泌体能够激活乳腺癌细胞中Notch3信号通路，增强乳肿瘤细胞的治疗耐受性[111]。

4.3 外泌体诱导EMT

EMT过程在调控CSC的自我更新与分化中起着重要的作用，且细胞通过EMT过程可获得干细胞表型。转化生长因子β (TGF-β)，其能够诱导EMT的发生，在近期研究中被发现存在于肿瘤细胞来源的外泌体中。例如，慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)来源的外泌体中富含TGF-β1，通过外泌体转运TGF-β1，促进白血病细胞的增殖、克隆形成以及体内成瘤[112]。结肠癌起始细胞释放的外泌体可转运cld7到低转移性的细胞中，诱导其发生EMT过程[113]。

4.4 转运重编程转录因子

重编程转录因子的异常表达能够诱导non-CSCs向CSCs转化，外泌体可通过转运这些转录因子亦或通过调控受体细胞中转录因子的表达水平来调控肿瘤干细胞的动态平衡。例如，前脂肪细胞分泌的外泌体通过转运转录因子SOX2和SOX9，促进早期乳腺癌形成和体内肿瘤生长[114]。

此外，外泌体所含miRNA对肿瘤细胞增殖、自我更新以及致瘤性也具有重要调控作用。黑色素瘤细胞来源的外泌体高表达miR-222，能够增加黑色素瘤细胞的恶性表型[115]；胃癌细胞可选择性将Let-7 miRNAs包装到外泌体中并释放到肿瘤微环境中，进而促进胃癌的恶性表型及肿瘤生长[34]。其他一些致癌性miRNA(oncomiRs)，如miR-21[116]、miR-34a[117]等也发现在肿瘤细胞来源的外泌体中大量存在。

表1 外泌体在维持肿瘤细胞干性表型中的作用

5 靶向外泌体与肿瘤治疗

综上可见，外泌体介导的细胞通讯在肿瘤发展与肿瘤干细胞动态平衡中发挥着重要的作用，因此，阻断外泌体的生物发生、释放、转运及其信号通路很有可能成为另一个新的肿瘤靶向治疗措施。

5.1 抑制外泌体的生物发生

近期研究发现参与外泌体发生的几种关键蛋白，如，ESCRT的组分参与MVBs和ILVs的形成[9]。一些研究发现敲除HRS、STAM1和TSG101能够减少外泌体的释放量，抑制这些ESCRT组分可改变囊泡的属性和内容物[118]。外泌体除了通过ESCRT依赖的途径产生外，鞘脂类神经酰胺亦可介导外泌体的产生，一种盐酸盐水合物(GW4869)能够诱导酸性鞘磷脂酶(aSMase)失去活性，用其处理细胞可减弱外泌体内体分选和产生[119]。此外，四跨膜交联分子(tetraspanin)也能够介导MVBs的产生，在大鼠胰腺癌细胞表达Tspan8能改变外泌体中的mRNA的含量和蛋白质的组成[120]。如果干扰或抑制四跨膜交联分子表达，有可能抑制胰腺癌细胞外泌体的生物发生。

5.2 抑制外泌体释放

Rab27家族是一类小GTP酶蛋白，在外泌体的释放中发挥重要的调控作用。通过干扰RNA技术抑制Rab27a的表达，能够减少肿瘤细胞释放外泌体，并抑制肿瘤生长及转移克隆的形成[121]。其他Rab蛋白，如Rab11、Rab35等也可通过抑制MVBs与质膜的结合从而消弱了外泌体的释放[12, 13]。另外，一些脂类也被证实参与调控外泌体的释放，研究发现下调二酰甘油激酶α的表达可抑制含有Fas配体的外泌体的释放[122]。大多数细胞外泌体的释放与胞内Ca2+浓度相关，升高胞内Ca2+浓度能够刺激外泌体的释放，而Na+/Ca2+交换通道的抑制剂二甲基阿米洛利(dimethyl amiloride, DMA)则能减弱Ca2+浓度升高引起的外泌体的释放[123]。

5.3 抑制外泌体摄取

细胞可通过多种途径将胞外环境中的外泌体摄入到胞内，包括胞饮、受体介导的胞吞作用以及直接与质膜融合等，虽然细胞内化外泌体的机制还不十分清楚，已有一些研究发现肿瘤来源的EVs的摄取似乎与其表面上的磷脂酰丝氨酸有关[124-125]。其他研究发现GBM细胞的EVs能通过存在于受体细胞上的肝素蛋白多糖(HSPGs)介导被摄取，利用肝素处理细胞，可干扰EVs与受体细胞的绑定，从而抑制了EVs引起的细胞表型的改变[126-127]。此外，通过下调一些与内吞作用相关的蛋白，如动力蛋白2[19]，也能抑制外泌体被受体细胞摄入。

综上，抑制外泌体的发生、释放和摄取可为治疗肿瘤提供新的潜在靶点。然而，问题是如何特异性地干扰肿瘤细胞这些途径而不影响正常细胞外泌体的发生、释放和摄取。因此，未来研究要寻找特异性抑制肿瘤细胞的外泌体的发生、释放和摄取的策略和方法，以增强其对肿瘤细胞的特异性和靶向性。具体见表2。

表2 靶向外泌体与肿瘤治疗可能途径

6 结语与展望

肿瘤干细胞(CSC)是一群具有干细胞样特性的肿瘤细胞，其可以驱动肿瘤的生长和复发，并对目前许多常规治疗具有耐受性。 CSC假说的提出对临床治疗策略将发生重要影响。然而，越来越多的研究表明，CSC是一群处于分化-去分化的动态平衡细胞，这就可以解释为何单一的抗癌或抗CSC药物不能杀伤所有肿瘤细胞或CSC的原因。外泌体是所活细胞分泌到胞外的纳米级囊泡，可通过转运其内容物调控受体细胞的基因表达和信号通路，从而介导细胞-细胞间的通讯，参与non-CSCs和CSCs间相互转化，并维持其动态平衡。外泌体可通过介导受体细胞发生EMT过程或调控干性相关的信号通路(如Wnt通路、Notch通路、Hedgehog通路等)以及其他途径而使non-CSCs重新获得干细胞表型，向CSCs转化。因此，我们推测，外泌体可作为non-CSCs和CSCs之间的动态平衡的调控器。一方面，来源于CSCs的外泌体，能将干性分子转移到non-CSCs，使其获得干性表型；另一方面，肿瘤细胞或肿瘤微环境中的基质细胞也可通过外泌体增加CSCs的形成和促进肿瘤的进展。

外泌体是所有活细胞分泌到胞外的纳米级囊泡，通过转运其内容物介导的细胞与细胞之间的信息传递,调控受体细胞的信号通路和基因表达；通过诱导受体细胞EMT或调控干性相关的信号通路(如Wnt、Notch、Hedgehog通路等)或通过其他途径而使non-CSCs重新获得干性表型，参与non-CSCs和CSCs间相互转化，并维持其动态平衡。因此，可以推测，外泌体可能作为维持non-CSCs和CSCs之间的动态平衡的信息载体(Information carrier)。一方面，来源于CSCs的外泌体，可将干性分子转移到non-CSCs，赋予其干细胞表型；另一方面，肿瘤细胞或肿瘤微环境中的其他细胞也可通过释放或摄入外泌体促进CSCs形成和肿瘤进展。

总之，外泌体作为信息载体，在维持non-CSCs和CSCs之间动态平衡中起着不可或缺的作用。靶向抑制外泌体的生物合成或通过干扰其形成、释放和摄取，阻断non-CSCs与CSCs之间的动态转化和动态平衡，从而清除肿瘤干细胞，根治肿瘤另辟蹊径。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测；

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

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ExosomesandCancerStemCellDynamicEquilibrium*

Sun Zhen1, Dong Lihua1,2,Wang Xiujie1△

(1.LaboratoryofExperimentalOncology,WestChinaClinicalMedicalSchool,SichuanUniversity,Chengdu, 610041,Sichuan,China; 2.HumanAnatomyDepartment,SchoolofPreclinicalandForensicMedcine,SichuanUniversity,Chengdu, 610041,Sichuan,China.)

Exosomes, expressing the specific surface molecules such as CD63 and CD81, are 30-100 nm extracellular vesicles, and contain a broad array of biologically active materials including DNA, mRNAs, ncRNAs, proteins, and lipids. Exosomes modulate signaling pathways and protein expression by transferring their molecular contents into receptor cells, and play crucial roles in mediating intercellular communication between tumor cells and their surrounding microenvironment. Cancer stem cells are a small kind of heterogeneous cells existed in tumor tissues or cancer cell lines. These cells possess stemness phenotype containing self-renewal ability and multi-potential differentiation which was considered as the reason for the failure of conventional cancer therapies and tumor recurrence. However, a highly dynamic equilibrium was found between cancer stem cells and cancer cells and this indicates that cancer stem cells are no more special target and blocking the transformation of cancer stem cells and cancer cells seem to be a more significant therapied strategy. As information transforming carrier between cells, whether exosomes regulated cancer cell transformation among cancer stem cell dynamic equilibrium, and targeting exosome signaling attenuated the formation of cancer stem cells and finally cure cancers, this is worthy of further study.

Exosomes; Cancer stem cells; Dynamic equilibrium; Tumor microenvironment; Targeting therapy

2017- 05- 10

2017- 09- 12

*国家自然科学基金(编号:31371148)

△王修杰，E-mail:xiujiewang@scu.edu.cn

R730.2

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.05.010

Sun Z ,Dong LH, Wang XJ. Exosomes and cancer stem cell dynamic equilibrium[J]. J Cancer Control Treat, 2017,30(5):373-384.[孙振,董立华,王修杰.外泌体与肿瘤干细胞动态平衡[J].肿瘤预防与治疗，2017,30(5):373-384.]