干腌火腿的蛋白质组学研究进展

张敬竟+刘姝韵+王桂瑛+程志斌+谷大海+徐志强+普岳红+廖国周

摘 要：干腌火腿是一种重要的传统发酵肉制品，其在长达10 个多月的加工过程中会发生显著的蛋白质降解现象，并产生大量小分子肽类与游离氨基酸。蛋白质组学技术以其高通量、高灵敏度及高准确性的特点被越来越多地应用于发酵肉制品蛋白质降解研究领域。本文主要综述了干腌火腿加工过程中蛋白质降解的研究进展，旨在为干腌火腿的品质调控提供参考依据。

关键词：干腌火腿；蛋白质组学；蛋白质降解

Progress in Proteomic Research of Protein Degradation in Dry-Cured Ham

ZHANG Jingjing1，2， LIU Shuyun1，2， WANG Guiying1，2， CHENG Zhibin2， GU Dahai1，2， XU Zhiqiang1，2， PU Yuehong1，2，*， LIAO Guozhou1，2，*

（1. College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；

2. Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province， Kunming 650201， China）

Abstract： Dry-cured ham is an important traditional fermented meat product of China. Significant protein breakdown occurs to produce a large quantity of small peptides and free amino acids during the processing of dry-cured ham， which lasts as long as over 10 months. Proteomics technology has been increasingly applied in the field of research on protein degradation in fermented meat products thanks to its characteristics such as high throughput， sensitivity and accuracy. This paper focuses on a review of recent progress in the research on protein degradation during the processing of dry-cured ham with the aim of providing a reference for the quality control of dry-cured ham.

Key words： dry-cured ham； proteomics； protein degradation

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708012

中圖分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）08-0060-04

干腌火腿是以猪后腿为原料，经以食盐为主的腌制剂干腌、干燥脱水和发酵成熟等主要工艺加工而成的一种具有典型质地和风味的肉制品，是最重要的传统肉制品类别之一。世界上著名的干腌火腿有西班牙的伊比里亚火腿和索娜拉火腿、法国的巴约纳火腿和科西嘉火腿以及中国的金华火腿和宣威火腿等[1]。干腌火腿需要经历长达10 个月或更长时间的加工过程，在这一过程中火腿本身会发生一系列生物化学反应，并形成其最终的特征质地和风味[2]。

在干腌火腿漫长的加工过程中，火腿中的肌肉蛋白质和脂肪发生了复杂的生物化学和物理化学变化，其中最重要的变化就是蛋白质的水解和脂肪的氧化分解[3]。蛋白质水解是内源酶导致的肌肉蛋白质的降解，是迄今为止干腌火腿加工过程中被研究最多的生物化学现象[4-5]，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE）和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是用于研究干腌火腿加工过程中的蛋白质变化、蛋白质分离及鉴定所产生的蛋白质片段，从而探究其风味物质形成机理的最常用手段[6-8]。本文主要对运用蛋白质组学技术分析干腌火腿的蛋白质降解规律及其多肽鉴定的研究进展进行综述，旨在为干腌火腿的品质调控提供参考依据。

1 干腌火腿的加工工艺

世界各国的干腌火腿加工普遍使用盐处理作为保存、干燥和加工的工艺手段，其主要目的是获得高附加值的产品，并且由于此种工艺所得产品的安全性高、感官特性良好，因此被消费者所赞赏，产品特性受原料和工艺过程的调节[9]。虽然国际上对干腌火腿进行加工的条件不同，但其实质均在于保持产品性质的稳定，以确保消费的安全性，同时促进产品感官特性的发展。

图1为Parma火腿的典型加工工艺流程，食盐在腌制期间逐步渗透进入原料肉，然后在烘干过程中通过火腿进行扩散，烘干结束时到达火腿内部，熟化和陈化期间的温度和湿度条件能够促进火腿中的生物化学反应[10]。蛋白质水解和脂肪氧化分解是干腌火腿风味物质产生的主要来源。在干腌火腿加工期间发生的主要生化反应为酶促反应，包括肌肉蛋白质水解、三酰基甘油和磷脂组分水解、葡萄糖水解和核苷酸转化[11]。美拉德反应、Strecker降解反应和一些风味前体物质的氧化分解反应也在该过程中发生，这些生物及化学反应均有助于产品最终质构、色泽和风味特征的形成[12]。endprint

2 干腌火腿加工过程中的蛋白质降解

蛋白质降解是干腌火腿加工过程中重要的生化反应过程，受工艺过程中的含盐量、水分活度和温、湿度的影响，这一过程中参与蛋白质降解的内源酶主要是组织蛋白酶B、L、D及钙酶、肌肉二肽酶和氨肽酶等[13]。由图2可知，内肽酶通过切割完整的蛋白质降解肌肉蛋白质，产生能够被肽链外切酶进一步降解的大分子多肽。肌肉内肽酶（如组织蛋白酶和钙酶）的作用直接决定宰后肌肉纹理的变化[14]，宰后肌肉成熟过程中Z盘肌原纤维破碎，蛋白质的降解增加了肉的柔软性。组织蛋白酶B、H、L在干腌火腿加工15 个月后仍具有活性[15-16]，而组织蛋白酶D的活性在加工6～10 个月后消失[17-18]。组织蛋白酶的活性对火腿的质地有显著影响，其活性过高时易导致火腿中蛋白质的过度降解，从而破坏肌肉结构，使火腿出现浆糊状的质地缺陷，损害火腿的感官品质[19]。钙酶仅在腌制过程的第1阶段参与肌肉蛋白质的水解，其稳定性较低且在2 周左右活性消失。氨肽酶在火腿加工12 个月后仍能检测到活性，这也是火腿加工后期游离氨基酸含量显著增加的原因。

3 干腌火腿加工过程所产肽类的鉴定

3.1 肽类的分离方法

干腌火腿蛋白质在酶的作用下逐步水解为多肽，这一过程控制着干腌火腿风味的形成速率。多肽的分子质量与加工期长短有关，赵改名等[20]对索娜拉火腿的研究表明，多肽存在4 500～2 700 D、2 700～1 200 D、1 200～500 D、500～375 D和375～160 D 5 个分子质量范围。火腿中多肽的分级和分离对于后续的质谱分析至关重要，使用高分辨率凝胶电泳，如小分子SDS-PAGE（tricine SDS-PAGE），可以将火腿风干期间由于蛋白质剧烈水解而产生的小蛋白片段、多肽和寡肽分離到1～30 kD的范围[21]。廖国周等[22]采用2-DGE分析宣威火腿的蛋白质组，共发现1 749 个蛋白点。Lametsch等[23]发现猪肉肌红蛋白在宰后贮藏期间及干腌火腿加工期间发生显著降解。Picariello等[24]使用2-DGE研究加工12 个月的巴约纳火腿，发现样品中的肌红蛋白发生部分水解，磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，muscle associated，PYGM）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）完全水解，烯醇化酶和磷酸甘油酸变位酶（phosphoglycerate mutase，PGAM）直到火腿风干结束后仍然存在，而丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是唯一在11 个月的干燥期后含量保持恒定的酶。

干腌火腿风干期间所产肽类的序列鉴定通常需要进一步的分离技术或与色谱技术结合，以纯化这一过程中产生的包含肽和蛋白质的复杂混合物。空间排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC）是一种非常简便的方法，火腿中的蛋白质经酸、有机溶剂或加热产生沉淀后，可以使用SEC对从火腿中提取出的一定平均分子质量的肽进行一级分馏[25-26]。二级分馏方法，如反向高效液相色谱（reversed phase-HPLC，RP-HPLC）已经与SEC组合使用，可以使目标肽得到精确分离，并且避免在随后的质谱分析中出现电离抑制现象。Shimonishi等[27]将质谱和埃德曼降解结合，并针对该方法开发了计算程序，能够对肽段混合物进行测序。Sentandreu等[28]通过凝胶过滤色谱法分离干腌火腿中的水溶性提取物，并通过RP-HPLC和阳离子交换色谱法分离最高浓度的肽级分，然后结合自动埃德曼降解法从N末端对包含2、3、4 个氨基酸的小肽进行测序。Sforza等[29]通过RP-HPLC和质谱（mass spectrometry，MS）鉴定从帕尔马干腌火腿中分离出低于500 D的寡肽，研究苦味和某些二肽（如Gly-Phe、Glu-Leu和Glu-Ile）之间的关系以及成熟风味与Glu-Tyr的相关性。Hughes等[30]使用SDS-PAGE和RP-HPLC作为定性方法，通过自动埃德曼降解测序从半干发酵香肠产生的肌质蛋白（肌红蛋白和CK）和肌原纤维蛋白（肌钙蛋白-I、肌钙蛋白-T和肌球蛋白轻链-2）中分离出5 个包含151～381 个氨基酸的结构肽。

3.2 肽类的测序方法

基于蛋白质组学研究，肉和肉制品中最常用的研究方法为使用限定的蛋白水解酶（如胰蛋白酶）将蛋白质消化成肽后，用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）获取肽质量指纹图谱[31]。?krlep等[32]根据基因型、食盐含量和发黏程度，使用2-DGE比较来自干腌火腿股二头肌的蛋白质级分，并通过MALDI-TOF/TOF中的蛋白质质量指纹图谱对蛋白质进行鉴定。di Luccia等[33]使用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS研究干腌火腿成熟期间肌动蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白轻链的变化规律，同时采用二维乙酸-尿素-Triton聚丙烯酰胺凝胶电泳（two dimensional acetic acid-urea-triton polyacrylamide gel electrophoresis，2D-AUT PAGE）和MALDI-TOF-MS作为主要分离技术，用肽质量指纹图谱鉴定从干腌火腿中分离的共13 种肌浆蛋白。结果表明，干腌火腿成熟过程中肌原纤维蛋白和肌质蛋白逐渐消失。Théron等[34]研究了巴约纳干腌火腿的股二头肌和半膜肌肌肉的蛋白质组学特征，成功分离了其中的蛋白质和多肽，并使用endprint

SDS-PAGE精確确定其分子质量和浓度。通过分析不同处理时间干腌火腿的蛋白质质量指纹图谱，发现半膜肌和股二头肌中分别有43 个和30 个蛋白质被确定为过度表达。

用串联质谱技术获得的数据与数据库中包含的理论序列匹配可以更快、更可靠地鉴定肽的序列。RP-HPLC与级分收集器串联可以分离和纯化主色谱峰，实现肽混合物的分离和纯化，用于随后的LC-MS/MS分析[35]。干腌火腿成熟期间鉴定天然产生的肽最常见的方法之一是通过SEC和RP-HPLC进行肽复杂混合物的分离，随后通过MALDI-TOF测定感兴趣级分中所含肽的分子质量[36]。Mora等[37]使用具有反相毛细管柱的纳米液相色谱法分离干腌火腿加工过程中产生的肽，并使用电喷雾四级杆飞行时间质谱（electrospray ionization-qudropole/time-of-flight

mass spectrometry，ESI-Q/TOF MS）进行分析，首次在干腌火腿中实现使用四极杆/离子阱质谱仪对肌原纤维蛋白和肌球蛋白轻链特定肽序列的测序，鉴定出肌动蛋白的4 个蛋白质片段。干腌火腿中的肌质蛋白（如CK和糖酵解酶体）也可以使用ESI-Q/TOF MS进行鉴定。

Mora等[38]用MALDI-TOF/TOF-MS对干腌火腿中肌钙蛋白-T的蛋白片段进行鉴定及测序，其研究结果能够证实其他研究者在对猪后腿宰后及宰后成熟期间的蛋白质进行研究时所发现的位点是肌钙蛋白-T的切割位点。

4 结 语

目前国内外对干腌火腿的研究主要集中在以下三方面：1）改善火腿加工工艺，缩短火腿生产周期；2）调控蛋白质水解程度，生产高品质火腿；3）降低火腿中的食盐含量[39]。对干腌火腿加工过程中的生物化学反应进行研究有助于了解蛋白质水解和肽类产生的机制，从而调控蛋白质水解，提升火腿的风味及品质。对干腌火腿加工过程中所产生的肽类进行蛋白质组学鉴定和测序有助于了解肌肉蛋白水解酶的作用机制，阐明火腿中肽、含氮化合物及羰基化合物等组分的生成规律，鉴定火腿中的特殊风味物质。优化蛋白质组学研究方法在关键肽的鉴定中具有重要作用，而关键肽可以作为生物标志物控制和指导干腌火腿的工业化生产，将其应用于酶反应的优化，可以使产物达到最佳质量，从而提高干腌火腿产品的产业效益[40-42]。

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