生鲜罗非鱼片专用复合天然防腐剂工艺优化

摘 要：以总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和菌落总数为指标，应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术比较研究8 种不同天然防腐剂对生鲜罗非鱼片中腐败菌生长的影响，并根据8 种天然防腐剂抑菌谱互补的原则配制出罗非鱼片专用的复合天然防腐剂，配方为20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL鱼精蛋白、1.2 g/100 mL壳聚糖。按此配方配制的复合天然防腐剂能够有效抑制罗非鱼片中腐败菌的生长，使贮藏在4 ℃有氧冷藏条件下的生鲜罗非鱼片的保质期延长至15 d以上，而不使用防腐剂的生鲜罗非鱼片保质期仅为9 d。

关键词：罗非鱼片；天然防腐剂；变性梯度凝胶电泳；菌落总数；总挥发性盐基氮

Optimization of the Formulation of Natural Preservative Mixtures for Fresh Tilapia Fillets

MENG Xiaohua

（School of Food Engineering， Hebi Polytechnic， Hebi 458030， China）

Abstract： In this experiment， polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE） was adopted to evaluate the effect of eight different natural preservatives on the growth of spoilage microorganisms in fresh tilapia fillets and the effect on total volatile basic nitrogen （TVB-N） content and aerobic plate count （APC） was also investigated. Taking into account their synergism， a preservative mixture was formulated containing 20% ginger juice， 20% garlic juice，

0.6 g/100 mL protamine， and 1.2 g/100 mL chitosan. This mixture could effectively inhibit the growth of spoilage microorganisms in tilapia fillets and prolong the shelf life to over 15 days compared to only 9 days for samples without any preservative treatment stored at 4 ℃.

Key words： tilapia fillets； natural preservative； denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； bacterial population；

total volatile basic nitrogen （TVB-N）

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708004

中图分类号：TS254.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）08-0018-05

防腐剂保鲜技术是借助天然或合成化学成分的杀菌或抑菌作用，单独或与其他保鮮方法相结合的保鲜方法。在生鲜鱼片中添加合成防腐剂一般不易被消费者接受，近年来，乳酸链球菌素（nisin）[1-2]、茶多酚[3-5]、壳聚糖[6-7]等安全、有营养的生物保鲜剂得到了广泛关注，但目前的研究多单独将某种天然防腐剂应用于鱼肉制品中，或将几种天然防腐剂复合使用，且全部基于经验或根据传统的抑菌谱实验（滤纸片法、稀释法、杯碟法、浊度法等）确定配方。上述方式具有明显的缺陷，例如由于鱼肉制品中的大部分微生物是不可培养的[8]，用传统的微生物分离及培养方法不可能确知鱼肉制品体系的腐败菌菌相，且上述抑菌谱实验对目前可分离、培养的微生物并没有完全涵盖，因此不能全面了解配方中各成分的防腐效果，也不能配制出针对性强、效力高的复合天然防腐剂。以基因（组）多样性反映物种多样性的聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，

PCR-DGGE）技术可靠性和重现性较好、方便快捷[9-10]，

可以比较全面客观地展现整个菌群多样性的动态变化。国内外已有研究将该方法用于鲫鱼[11]、三文鱼[12]、

草鱼[13]及其他鱼肉制品[14-16]中微生物的分析，但我国对于生鲜罗非鱼片防腐保鲜方面的研究鲜有报道。本研究应用PCR-DGGE技术研究8 种天然防腐剂对生鲜罗非鱼片上腐败菌生长代谢的影响，合理组合不同防腐剂，针对性地抑制罗非鱼片中微生物的生长，研制生鲜罗非鱼片专用天然防腐剂，以延长产品的保质期。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜罗非鱼片 茂名市海名威水产科技有限公司。

细菌基因组DNA快速提取试剂盒 广州东盛生物科技有限公司；DNA Marker DL2000 德国Newgene Biotechnology公司；Go Taq Green Master Mix（2×） 美国Promega公司；溴化乙锭（ethidium bromide，EB）、6×上样缓endprint

冲液 北京中生瑞泰科技有限公司；Goldview染料（含量≥95%） 上海范柏实业有限公司。

1.2 仪器与设备

2001-220DGGE电泳仪 美国CBS Scientific公司；Gel-Dol 2000凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；T196DNA扩增仪 德国Biometra公司；DYCP-31CN水平电泳仪 北京六一仪器厂；TPX-20MC紫外观测台 法国Vilber Lourmat公司；DSHZ-300A旋转式恒温振荡器 太仓市实验设备厂；TL-MM-1微量振荡器 广州云荟贸易有限公司；SW-CJ-1FDA超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；YX-280A手提式压力蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司；PB-10 pH计 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；E-201-C-9复合电极 上海精密科学仪器有限公司；7250紫外分光光度计 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 8 种天然防腐剂的配制

新鲜大蒜、生姜榨汁，过滤后得清液为原汁，用无菌蒸馏水稀释原汁，分别配制成体积分数为20%和60%的溶液；称取壳聚糖0.4、1.2、2.0 g，分别用1%醋酸溶液溶解、定容至100 mL，用稀氢氧化钠溶液调节pH值至6.2；称取茶多酚、Nisin、鱼精蛋白、ε-聚赖氨酸各0.2、0.6、1.0 g，分别用无菌蒸馏水溶解、定容至100 mL；称取溶菌酶0.1、0.3、0.5 g，分别用无菌蒸馏水溶解、定容至100 mL。

1.3.2 8 种天然防腐剂最佳防腐浓度的确定

将生鲜罗非鱼片分别浸泡在不同浓度的8 种天然防腐剂溶液中5 min，沥干后置于4 ℃冰箱中，定期取样进行菌落总数和总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的测定，确定不同防腐剂的最佳防腐浓度。以浸泡无菌蒸馏水的鱼片作为对照。

1.3.3 生鲜罗非鱼片的PCR-DGGE分析

用最佳防腐浓度的8 种天然防腐剂分别浸泡生鲜罗非鱼片5 min，沥干后置于4 ℃冰箱中，冷藏6 d时取样进行PCR-DGGE分析。以浸泡无菌蒸馏水的鱼片作为对照。

1.3.4 复合天然防腐剂的防腐效果研究

根据抑菌谱结果，针对性地将几种天然防腐剂按一定比例进行复配，将生鲜罗非鱼片在复合天然防腐剂中浸泡后，4 ℃贮藏，定期取样分析。

1.3.5 指标测定

菌落总数测定：按照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]；TVB-N值测定：按照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[18]中的微量扩散法进行测定。

1.3.6 PCR-DGGE分析

DNA提取：在无菌操作台用无菌剪刀剪取鱼肉10 g于灭菌锥形瓶（内有10 g 玻璃珠和90 mL生理盐水）中，摇床振荡30 min，静置后取20 mL上清液于无菌离心管中，10 000 r/min离心20 min，得菌体沉淀。按试剂盒说明书提取细菌DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR扩增：参照孟晓华等[19]的方法，采用巢氏PCR扩增细菌DNA的16S rDNA的V3可变区。第1轮扩增大小约为800 bp的细菌16S rDNA序列，引物为8F/798R，由上海捷瑞生物工程有限公司合成[20]。扩增体系：Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25 个循环；最后72 ℃延伸2 min。第2轮扩增细菌16S rDNA的V3区片段，引物为GC 338F/518R[21-22]，以第1轮PCR扩增产物为模板，用降落PCR进行扩增。扩增体系：Go Taq Green Master Mix（2×）25 μL、引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 22 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min，然后使用降落PCR程序[23]，20 个循环（94 ℃变性1 min；退火温度从65 ℃到55 ℃，退火30 s；72 ℃延伸3 min），再于恒定退火温度下进行10 个循环（94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min），最后72 ℃再延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

DGGE分析：采用质量浓度为80 g/L的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为40%～60%（100%变性剂：7 mol/L尿素+

体积分数40%的甲酰胺），在1×TAE（三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸，tris base-acetic acid-EDTA，TAE）緩冲液中，60 ℃、150 V条件下电泳5 h。胶片用含0.5 mg/L EB的1×TAE缓冲液染色，用凝胶成像系统进行拍照和图像分析。

条带回收和测序：参照Toffin等[24]的方法，在紫外观测台上切下胶片各泳道的主要条带，溶于30 μL ddH2O中，捣碎、混匀，置于4 ℃条件下过夜。以10 μL回收DNA溶液为模板，用338F（无GC夹）/518R引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳测定产物的产量及特异性。采用割胶纯化法对PCR产物进行纯化，将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化DH5α细胞，对阳性克隆株进行测序。DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，测序后获得的细菌16S rDNA序列，登录NCBI网站进行查询和比对[25]。

1.4 数据处理

使用Excel 2003软件进行数据整理和绘图，SAS软件进行方差分析。样品均平行测定3 次，结果以平均值±标准差表示。endprint

2 结果与分析

2.1 不同浓度的8 种天然防腐剂的防腐效果比较

由表1可知，经不同浓度和种类防腐剂处理的罗非鱼片冷藏过程中的菌落总数和TVB-N值均低于对照组，说明8 种天然防腐剂对罗非鱼片均有一定的防腐效果，且8 种天然防腐剂的最佳防腐浓度分别为生姜溶液20%、大蒜溶液60%、溶菌酶0.5 g/100 mL、茶多酚0.6 g/100 mL、nisin 1.0 g/100 mL、鱼精蛋白0.6 g/100 mL、壳聚糖1.2 g/100 mL、ε-聚赖氨酸0.6 g/100 mL。

2.2 生鲜罗非鱼片上腐败菌的PCR-DGGE分析

1. 对照；2. Nisin；3. 茶多酚；4. ε-聚赖氨酸；5. 鱼精蛋白；

6. 壳聚糖；7. 生姜溶液；8. 大蒜溶液；9. 溶菌酶。

DGGE图谱上的不同条带代表不同的细菌，条带的亮度则反映细菌的数量，条带越亮表示细菌的数量越多[21]。由图1可知，不同种类的天然防腐剂对罗非鱼片上细菌生长的影响不同。切割图1中各电泳条带进行测序的结果如表2所示，8 种不同种类的天然防腐剂对DGGE条带对应相似菌株生长情况的影响如表3所示。

2.3 复合天然防腐剂的防腐效果

根据8 种天然防腐剂抑菌谱互补的原则，优选生姜、大蒜、壳聚糖和鱼精蛋白4 种天然防腐剂，按比例复配（20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL鱼精蛋白、1.2 g/100 mL壳聚糖）后，浸泡罗非鱼片，研究复合天然防腐剂的防腐效果。以浸泡无菌蒸馏水的鱼片作为对照。

1. 对照组，贮藏0 d（未腐败）；2. 对照组，贮藏9 d（开始腐败）；3. 对照组，贮藏15 d（严重腐败）；4. 复合天然防腐剂处理组，贮藏9 d（未腐败）；5. 复合天然防腐剂处理组，贮藏15 d（开始腐败）；6. 复合天然防腐剂处理组，贮藏21 d（严重腐败）。

由图2可知，与对照组相比，经复合天然防腐剂处理的鱼片感官品质下降较为缓慢。对照组鱼片的TVB-N值和菌落总数显著高于复合天然防腐剂处理组（P<0.05），冷藏9 d时对照组鱼片的TVB-N值达21.2 mg/100 g，超过国家限量标准（20 mg/100 g）[26]，而冷藏15 d时复合天然防腐剂处理组鱼片的TVB-N值仅为18.69 mg/100 g。冷藏9 d时对照组鱼片的菌落总数和冷藏15 d时复合天然防腐剂处理组基本持平。可见，复合天然防腐剂能有效抑制罗非鱼片TVB-N值和菌落总数的升高，从而有效延长罗非鱼片的保质期。

由图3和表4可知，與1号泳道相比，4号泳道没有a、b条带；与2号泳道相比，5号泳道没有b、d条带，且e、f、g条带亮度较弱；与3号泳道相比，6号泳道各条带亮度较弱；1、2、3号泳道的c、d、e、f、g条带亮度依次增强，4、5、6号泳道的c条带亮度依次增强，a条带从无到有。这表明复合天然防腐剂处理组罗非鱼片与对照组相比，其菌相构成在冷藏的各个阶段均存在较大差异。对照组鱼片中细菌种类较多，且各类细菌的数量随冷藏时间的延长逐渐增多，而复合天然防腐剂处理组鱼片的假单胞菌数量明显比对照组少，且菌相构成较为单一。研究表明，有氧低温冷藏（0～15 ℃）淡水鱼的特定腐败菌是假单胞菌，而寒带和温带海域鱼类有氧冷藏过程中的特定腐败菌是耐冷的革兰氏阴性假单胞菌和（或）希瓦氏菌[27-28]。本研究结果表明，复合天然防腐剂能有效抑制罗非鱼片中的大部分细菌，且对导致罗非鱼片腐败的特定腐败菌假单胞菌也有一定的抑制作用。综合感官品质、TVB-N值和菌落总数的变化可知，复合天然防腐剂能够有效地将生鲜罗非鱼片的保质期延长至15 d以上，而不使用防腐剂的生鲜罗非鱼片保质期仅为9 d。

3 结 论

本研究以TVB-N值和菌落总数为指标，结合PCR-DGGE技术研究8 种天然防腐剂对生鲜罗非鱼片中腐败菌生长的影响，并根据8 种天然防腐剂抑菌谱互补的原则配制出罗非鱼片专用的复合天然防腐剂，配方为20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL鱼精蛋白、1.2 g/100 mL壳聚糖，按此配方配制的复合天然防腐剂能够有效抑制罗非鱼片中腐败菌的生长，使贮藏在4 ℃有氧冷藏条件下的生鲜罗非鱼片的保质期延长至15 d以上。本研究中的复合天然防腐剂能够实现对样品中腐败菌的靶向抑制，且能够快速复配，高效、安全。

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