人参提取物对过氧化氢致人神经母瘤细胞损伤的保护作用及机制研究

张慧媛++++++杨擎++++++孙佳明++++++刘英娜++++++林嘉楠++++++石晓征++++++李娜++++++曲晓波

[摘要] 目的 观察人参提取物对过氧化氢致人神经母瘤细胞（SH-SY5Y）损伤的影响并探讨其作用机制。 方法 采用MTT法确定人参二醇总皂苷（PDS）、人参总皂苷（GS）、人参非皂苷（GN）的最佳给药浓度。将处于对数生长期的SY5Y细胞加入过氧化氢（终浓度为300 μmol/L）孵育4 h造成细胞损伤模型，然后分为模型对照组、PDS给药组、GS给药组、GN给药组，另设空白对照组加入等体积细胞培养液。采用MTT方法检测细胞活力，Western blot法检测Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表达情况。 结果 与空白对照组相比，模型组对照组SH-SY5Y细胞存活率明显降低（P < 0.01）；与模型对照组比较，PDS给药组、GS给药组、GN给药组细胞存活率均升高，确定1、10、240 μg/mL为PDS给药组、GS给药组、GN给药组实验浓度（P < 0.01）。与空白对照组比较，模型对照组SH-SY5Y中Keap1、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表达水平明显增加（P < 0.05或P < 0.01），Bcl-2、Nrf-2表达明显降低（P < 0.01）；与模型组对照组比较，PDS给药组、GS给药组SH-SY5Y中Keap1、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表达水平明显降低（P < 0.05或P < 0.01），Bcl-2、Nrf-2表达明显增高（P < 0.01）。 结论 人参提取物中PDS与GS对过氧化氢致人神经母瘤细胞SY5Y細胞损伤具有保护作用，其机制可能与通过激活SH-SY5Y细胞内Nrf-2通路抑制氧化应激、降低其凋亡发生有关。

[关键词] 人参二醇总皂苷；人参总皂苷；人参非皂苷；过氧化氢；神经母瘤细胞损伤

[中图分类号] R329.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（c）-0013-05

Protective effect and mechanism of ginseng extract on human neuroblastoma injury induced by hydrogen peroxide

ZHANG Huiyuan YANG Qing SUN Jiaming LIU Yingna LIN Jia′nan SHI Xiaozheng LI Na QU Xiaobo

Molecular Pharmacology Laboratory， Changchun University of Traditional Chinese Medicine R&D Center， Jilin Province， Changchun 130117， China

[Abstract] Objective To observe the influence of ginseng extract on the injury induced by hydrogen peroxide in human neuroblastoma cells （SH-SY5Y） and explore its mechanism. Methods The optimal concentrations of panaxadiol saponins （PDS）， ginsenoside（GS） and ginseng non-saponin（GN） were determined by the MTT assay. SY5Y cells in the logarithmic growth phase were supplemented with hydrogen peroxide （final concentration of 300 μmol/L） and were incubated for 4 h. The cell injury model was established. SY5Y cells were divided into model control group， PDS group， GS group and GN group. A blank control group was added to an equal volume of cell culture fluid. MTT assay was used to detect the cell viability. The protein expressions of Nrf2， Keap1， Bcl-2， Bax， Caspase3 and Caspase9 were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group， the survival rate of SH-SY5Y cells in the model control group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model control group， the survival rates of PDS group， GS group and GN group increased， and the concentration of 1， 10， 240 μg/mL was selected as test concentration in PDS group， GS group and GN group （P < 0.01）. Compared with the blank control group， the protein levels of Keap1， Bax， Caspase3 and Caspase9 in SH-SY5Y of model control group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the protein levels of Bcl-2 and Nrf-2 were significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model control group， in PDS group and GS group the protein levels of Keap1， Bax， Caspase3 and Caspase9 were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the protein levels of Bcl-2 and Nrf-2 were significantly increased （P < 0.01）. Conclusion PDS and GS from ginseng extract can protect human SH-SY5Y cells from the hydrogen peroxide-induced damage， and the mechanism may inhibit the oxidative stress by activating the Nrf-2 pathway in SH-SY5Y cells， and reduce apoptosis.endprint

[Key words] Panaxadiol saponins； Ginsenoside； Ginseng non-saponin； Hydrogen peroxide； Neuroblastoma injury

氧自由基对脑神经细胞具有氧化修饰作用，是导致神经元损伤的主要途径之一[1]。近年来越来越多的资料证明，氧化应激和线粒体参与可能是阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）主要的触发因素[2]。细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）通过诱导抗氧化反应元件（ARE）驱动基因核转录因子E2相关因子2（Nrf2）的激活引起细胞抗氧化反应[3-4]。人参皂苷是人参主要活性成分，可以通过抗凋亡、抗氧化等一系列机制保护神经[5]。有研究表明，人参皂苷Rg1可以修复过氧化氢诱导的氧化损伤[6]，其作用机制与抗氧化抑制细胞凋亡相关[7]。本研究主要观察人参提取物中人参二醇型总皂苷（panaxadiol saponins，PDS）、人参总皂苷（ginsenoside，GS）、人参非皂苷（ginseng non-saponin，GN）对过氧化氢诱导的SY5Y细胞损伤的影响，并探讨其机制与抑制氧化应激及凋亡的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 SH-SY5Y细胞由吉林大学基础医学院药理实验室提供。

1.1.2 主要试剂 人参二醇型总皂苷（hongjiu biotech公司，批号161204），人参总皂苷（hongjiu biotech公司，批号161101），人参非皂苷长春中医药大学自制。使用时用1640培养液稀释配制成所需浓度工作液。β-actin（美国Proteintech公司，批号66009-1-Ig），Nrf2（美国Proteintech公司，批号16396-1-AP），Keap1（美国Proteintech公司，批号10503-2-AP），Bcl-2（美国Proteintech公司，批号12789-1-AP），Bax（美国Proteintech公司，批号50599-2-Ig），Caspase3（美国Proteintech公司，批号20538-1-AP），Caspase9（美国Cell Signaling Technolocy公司，批号#14697）。过氧化氢（北京化工厂，批号：20160218），四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Amresco 公司，批号40201ES80），RPMI-1640（美国Corning公司，批号10-040-CVR），组织细胞裂解液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：WB-0061），胎牛血清（美国Gibco公司，批号FB15015），BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号CW0051S）。

1.1.3 仪器 酶标仪（TECAN公司），蛋白电泳仪（Hoffer公司），转膜仪（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理 将SH-SY5Y细胞用RPMI-1640培养基（10%胎牛血清，1%双抗）放入含有5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞处于对数生长期进行实验及相关指标检测。SH-SY5Y细胞分为空白对照组、模型对照组、PDS给药组、GS给药组、GN给药组。细胞接种24 h后配PDS浓度为1、5、10 μg/mL；GS浓度為10、50、100 μg/mL；GN浓度为240、1200、2400 μg/mL培养24 h。除空白对照组外均给予过氧化氢300 μmol/L孵育细胞4 h，消化收集细胞测定各项指标。

1.2.2 细胞存活率测定 采用MTT法。SH-SY5Y细胞以每孔4×104个/mL接种于96孔板中，每组细胞8复孔，培养结束前4 h每孔加入20 μL MTT，培养结束后吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，使结晶完全溶解，在490 nm波长下测定吸光度（A）值。空白对照组细胞存活率设为100%，计算其余各组细胞存活率。细胞存活率=（各实验组A值/空白对照组A值）×100%。

1.2.3 氧化应激相关凋亡蛋白表达的检测 采用Western blot法。细胞经分组处理后胰酶消化收集，提取蛋白，进行SDS-PAGE垂直电泳，然后电转至PVDF膜上，转膜后用TBST清洗膜3次，脱脂奶粉封闭1 h，再用TBST洗膜。将膜放入稀释好的β-actin、Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax、Caspase9和Caspase3抗体中，4℃孵育过夜，在二抗中室温孵育1 h，TBST洗膜，在BCIP/NBT显色液中避光显色，用凝胶成像分析系统测定灰度值。各组蛋白表达相对强度=每个样本条带灰度值/β-actin条带灰度值，进行半定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度梯度PDS、GS、GN对SY5Y细胞抗凋亡作用24 h筛选

与空白对照组相比，模型对照组细胞存活率明显降低（P < 0.01）；与模型对照组比较，PDS给药组1、5、10 μg/mL细胞存活率显著升高（P < 0.01），选取有效浓度的最低剂量即1 μg/mL做后续指标检测；GS给药组、GN给药组分别选取有效浓度的最低剂量为10、240 μg/mL做后续指标检测（P < 0.01）。

2.2 人参提取物对过氧化氢损伤SH-SY5Y细胞形态的影响

处理后的细胞于倒置显微镜下观察并拍照。实验结果表明：空白对照组细胞胞体呈梭形；模型对照组细胞数量减少，胞体皱缩，且有的细胞呈圆形；与模型对照组相比，PDS给药组、GS给药组细胞数量增多，胞体皱缩现象明显改善；GN给药组胞体皱缩现象明显改善，但是数量增多不明显。见图1。endprint

2.3 人参提取物对过氧化氢损伤SH-SY5Y细胞氧化应激相关蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比，模型对照组Nrf2表达明显减少（P < 0.01），Keap1表达明显增加（P < 0.01）；与模型对照组相比，PDS给药组、GS给药组Nrf2表达明显增加（P < 0.01），Keap1表达明显减少（P < 0.01），GN给药组Nrf2表达水平增强不明显（P > 0.05），Keap1表达水平明显减弱（P < 0.01）。

2.4 人参提取物对过氧化氢损伤SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比，模型对照组Bcl-2表达水平明显减弱（P < 0.01），Bax、Caspase9、Caspase3表达水平明显增强（P < 0.05或P < 0.01）；与模型对照组相比，PDS给药组、GS给药组Bcl-2表达水平明显增强（P < 0.01），GN给药组Bcl-2表达水平增强不明显（P > 0.05）；PDS给药组、GS给药组、GN给药组Bax、Caspase9、Caspase3表达水平较模型对照组明显减弱（P < 0.05或P < 0.01），但GN给药组减弱效果稍弱。见图3、表5。

3 讨论

人参皂苷具有多靶点、毒副作用小等优势，已成为近年来治疗神经退行性疾病的研究热点[8]。氧化应激在神经退行性疾病相关的神经细胞死亡中发挥重要作用[9-10]，Nrf2在细胞抗氧化反应中发挥关键作用[11]。正常生理状态下Nrf2被Keap1限制在细胞浆内，当发生氧化应激时，Keap1与Nrf2解联，新合成的Nrf2转移到细胞核内，识别并结合ARE，从而启动下游抗氧化蛋白基因的转录，提高细胞的抗氧化能力[12]。Keap1-Nrf2信号传导已成为预防和治疗氧化应激相关疾病和病症的有吸引力的靶标[13-14]。AD患者脑中Nrf2定位在细胞核，表达水平较正常对照组明显下降[15]。本研究采用300 μmol/L过氧化氢处理SH-SY5Y细胞诱发氧化应激损伤，利用MTT对3种不同人参提取物筛选最佳浓度，采用有效浓度的最低剂量进行实验，最终确定以1、10、240 μg/mL为PDS给药组、GS给药组、GN给药组实验浓度，进行后续Western blot指标检测。结果发现：与空白对照组相比，模型对照组Nrf2表达水平明显减少，Keap1表達水平明显增强。与模型对照组相比，PDS给药组、GS给药组SH-SY5Y细胞Nrf2表达水平明显增强，Keap1表达水平明显减弱；GN给药组Nrf2表达水平增强效果不明显，Keap1表达水平减弱效果明显。说明PDS与GS有抗氧化应激的神经保护作用，能阻止Nrf2与其阻遏蛋白Keap1结合，从而使Nrf2更好地发挥抗氧化作用，GN抗氧化效果不如PDS与GS明显。

Bax是最早发现的促凋亡家族成员，在正常细胞中主要存在于细胞质中，受到凋亡刺激后转位到线粒体上，引起细胞色素C的释放[16]。Bcl-2是其家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，Bcl-2/Bax组成一个体系，Bax表达增多，可致细胞凋亡，而Bcl-2表达增多则抑制细胞凋亡[17]。Caspase9作为凋亡启动因子处于级联反应的上游，可以识别及激活下游的Caspase-3。Caspase-3在细胞凋亡过程中作为主要效应因子，其活化是细胞进入凋亡不可逆阶段的标志[18-20]。本研究分别采用PDS、GS与GN处理过氧化氢损伤神经细胞，比较其抗凋亡作用，结果表明，与空白对照组相比，模型对照组Bcl-2表达水平明显减弱，Bax、Caspase9、Caspase3表达水平明显增强；与模型对照组相比，PDS给药组、GS给药组Bcl-2表达水平明显增强，GN给药组Bcl-2表达水平增强不明显；PDS给药组、GS给药组、Bax、Caspase9、Caspase3表达水平明显减弱，GN给药组减弱效果稍弱。说明PDS与GS具有抑凋亡、保护神经细胞的作用，GN抗凋亡效果不如PDS与GS明显。

综上所述，PDS与GS可能通过促使受损SY5Y细胞中Nrf2与Keap1脱离进入细胞核，提高下游抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax比值，抑制Caspase-9、Caspase-3表达，提高细胞的存活率，因此，PDS与GS对过氧化氢诱导的细胞损伤起到保护作用。机制可能与激活Nrf2信号通路并抑制凋亡有关。PDS与GS是否可以作为一种潜在治疗AD的药物，还有待进一步研究。

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（收稿日期：2017-07-17 本文编辑：程 铭）endprint