温州地区鸡肠道大肠埃希菌耐药性分析及血清型鉴定

侯凤香 ，李培德，金俊杰，金大春，陈溥言

(1.温州科技职业学院动物科学学院，浙江温州 325006；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095)

兽医临床

温州地区鸡肠道大肠埃希菌耐药性分析及血清型鉴定

侯凤香1，李培德1，金俊杰1，金大春1，陈溥言2

(1.温州科技职业学院动物科学学院，浙江温州 325006；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095)

为研究温州地区鸡肠道大肠埃希菌的耐药性和血清型，从27家养鸡场采集泄殖腔拭子355份，分离并鉴定出346株鸡大肠埃希菌，分离率为97.46%。在346株分离株中，对3种以上抗菌药物耐药的菌株占84.39%(292/346) ，呈现多重耐药性。O血清型鉴定结果显示，分离菌株分别属于13个血清型，其中O138、O146、O136、O45占分离菌株的39.02%(135/346)，为优势血清型。

鸡；大肠埃希菌；耐药性；血清型

大肠埃希菌是一种重要的病原，是构成胃肠道正常菌群的主要革兰阴性兼性厌氧菌。在正常的雏鸡体内，肠道中10%～15%的大肠埃希菌属于潜在致病菌[1]。大肠埃希菌在动物居住的环境中大量存在，通过粪-口途径传播。在特定条件下，能够导致鸡发病，随宿主的年龄和感染方式的不同，表现形式多样。大多数商品鸡群都发生过一定程度的由大肠埃希菌感染造成的发病、死亡等，从多方面给养禽业造成了巨大损失。

禽类和其他动物的致病性大肠埃希菌具有共同的血清型、毒力因子以及耐药性，而且禽大肠埃希菌菌株可能是编码耐药因子和毒力因子的基因或质粒的来源[2]。禽类产品常被含有毒力因子和耐药因子的大肠埃希菌污染，经常成为人感染大肠埃希菌的来源。禽的大肠埃希菌分离株对人用抗菌药物的耐药性最小，但业已证明耐药性细菌或质粒从家禽到人之间的传递现象是普遍存在的[3-5]。

本研究从温州27家鸡场，采集临床健康鸡泄殖腔拭子，分离出346株大肠埃希菌，选取20种抗菌药物，进行耐药性检测，并进行血清型鉴定。为制定有效的用药方案及控制大肠埃希菌耐药性发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 346株菌株分别采集自温州11个县市区27家鸡场内的临床健康鸡群；大肠埃希菌质控菌株ATCC25922，购自温州康泰生物科技有限公司。

1.1.2 培养基 Kary-Blair运送培养基，青岛海博生物技术有限公司产品；麦康凯、伊红美蓝、营养琼脂、MH平皿培养基，温州康泰生物科技有限公司产品。

1.1.3细菌微量生化反应管与药敏纸片 肠杆菌科微量生化反应管、链霉素(S)、卡那霉素(K)、庆大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、妥布霉素(TOB)、大观霉素(SH)、复方新诺明(SXT)、氨苄西林(AMP)、头孢唑林(KZ)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)、阿莫西林/棒酸(AMC)、诺氟沙星(NOR)、氧氟沙星(OFX)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、四环素(TE)、多西环素(DO)、氟苯尼考(FFC)药敏纸片，杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 大肠埃希菌O抗原诊断血清 大肠埃希菌O抗原诊断血清，天津生物芯片技术有限责任公司产品，包括53种O抗原单价血清。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离、鉴定 采集临床健康鸡泄殖腔拭子样品，移入Kary-Blair运送培养基内，于12 h内划线接种至麦康凯平皿培养基中，37℃培养18 h。挑取麦康凯平皿培养基上粉红色单个菌落，划线接种至伊红美蓝平皿培养基内，37℃培养18 h。挑取伊红美蓝平皿培养基上深紫色、带金属光泽单个菌落，划线接种至营养琼脂平皿培养基内，37℃培养18 h[6]。将待检菌接种至肠杆菌科微量生化反应管中，37℃培养培养24 h～96 h ，观察并记录生化反应结果，按说明书予以判定。

1.2.2 药敏试验 按照临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 推荐的K-B药敏纸片法进行药敏试验，每次测定均以质控菌株ATCC25922为参照。根据CLSI—2016标准判定结果[7]。

1.2.3 血清型鉴定 血清型鉴定参照天津生物芯片技术有限责任公司提供的产品说明书进行。

2 结果

对355份鸡泄殖腔拭子样品进行大肠埃希菌分离培养，经生化鉴定得到346株大肠埃希菌，分离率为97.46%。

2.1 药物敏感性结果

分离到的346株鸡肠道大肠埃希菌对20种抗菌药物均表现出不同程度的耐药性。其中对四环素耐药率最高，达84.10%；对氨苄西林、新诺明、多西环素保持很高的耐药率，均达到70%以上；对头孢曲松、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟、阿莫西林/棒酸、卡那霉素、头孢唑林、链霉素、氟苯尼考保持较高的耐药率，(39.02%～58.67%)；对妥布霉素、氧氟沙星、庆大霉素表现轻度耐药性(28.90%～31.5%)；对阿米卡星、大观霉素敏感，耐药率分别为6.94%和7.80%；对头孢哌酮/舒巴坦最敏感，耐药率仅为0.87%(表1)。

2.2 多重耐药性结果

在346株鸡肠道大肠埃希菌分离株中，有15株对所有20种抗菌药物敏感；无对20种抗菌药物均耐药的菌株；1株对19种抗菌药物耐药(19R)；8株对1种抗菌药物耐药(1R)，31株对2种抗菌药物耐药(2R)。在受试菌株中，3R以上菌株占84.39%(292/346)，多重耐药性结果见图1。

表1 鸡肠道大肠埃希菌分离株药敏试验结果Table 1 Drug sensitivity test result of avian intestinal Escherichia coli isolates

图1 鸡肠道大肠埃希菌对20种抗菌药物的多重耐药性分布Fig.1 Multiple drug resistance distribution of avian intestinal Escherichia coli isolates to 20 antimicrobial drugs

2.3 血清型结果

对346株鸡肠道大肠埃希菌分离株进行血清型鉴定，其中75株未定型，其余271株分别属于13个血清型，包括O1、O20、O29、O45、O78、O86、O91、O112、O117、O136、O138、O143、O146，其中O138、O146、O136、O45血清型数量较多，占分离菌株39.02%(135/346) ，为优势血清型(表2)。

表2 鸡肠道大肠埃希菌分离株的血清型Table 2 Serotypes of avian intestinal Escherichia coli isolates

3 讨论

集约化饲养的家禽，应用抗菌药物促进动物生长，预防相关细菌性疾病，是广泛使用的策略，但也导致耐药性细菌的泛滥，通过多种途径到达人群。动物源耐药性细菌(如大肠埃希菌和肠球菌)，能够定居在人类的肠道，成为人类病原菌耐药性基因的潜在来源[5]。

大肠埃希菌耐药情况较为复杂，不同地区菌株耐药性差异较大。本研究调查了温州地区健康鸡群肠道大肠埃希菌对20种抗菌药物的耐药性情况，结果显示，本地区鸡肠道大肠埃希菌分离株对四环素、氨苄西林、新诺明、多西环素、氟苯尼考、链霉素、头孢唑林、卡那霉素、阿莫西林/棒酸、头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、头孢曲松等14种抗菌药物保持较高的耐药性，与刘聚祥等报道的我国多个地区鸡致病性大肠埃希菌对四环素类、氟喹诺酮类药物耐药率较高相一致；本试验分离菌株对庆大霉素、妥布霉素、氧氟沙星耐药程度较轻，对阿米卡星、大观霉素敏感，分离菌株中仅有3株对头孢哌酮/舒巴坦耐药。表明本地区鸡肠道大肠埃希菌耐药性严重。本地区养殖户未使用过妥布霉素，但却有100株分离菌株对其耐药，可能是因为在其他氨基糖苷类药物的选择压力下，携带钝化酶基因的菌株所致[8]。有3株分离菌株对头孢哌酮/舒巴坦保持耐药性，该药在本地养殖场也从未被使用过，可能因为在其他头孢类抗生素的选择压力下，筛选出产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌所致[9-11]。

本研究显示，温州地区鸡肠道大肠埃希菌3R以上菌株占84.39%，最多的耐19种药物，多重耐药性问题严重，与国内外其他学者报道的食品动物源大肠埃希菌的耐药性不断发展的趋势相一致，即大肠埃希菌的耐药谱越来越广[12-15]。

国内学者报道，从不同地区发病鸡分离到的菌株，血清型种类较多，张燕飞等[16]从宁夏分离的鸡致病性大肠埃希菌优势血清型为O15、O18、O78、O88；丁伯良等[17]报道天津市鸡致病性大肠埃希菌优势血清型为O78、O88、O2、O45、O53、O145;岳阳市鸡致病性大肠埃希菌以O78、O1、O2、O55为优势血清型[18]；扬州市鸡致病性大肠埃希菌优势血清型为O78、O2、O127、O18、O1[19]；马兴树等[20]研究发现，冀南地区鸡致病性大肠埃希菌优势血清型为O78、O65、O1、O93、O141；杨斌等[21]报道云南省鸡致病性大肠埃希菌优势血清型为O78、O11、O88；锦州市鸡致病性大肠埃希菌优势血清型为O15、O35[22]；本试验分离到的健康鸡肠道大肠埃希菌菌株分别属于O1、O20、O29、O45、O78、O86、O91、O112、O117、O136、O138、O143、O146等13个血清型，其中O138、O146、O136、O45为优势血清型，与上述学者从发病鸡分离到的菌株差异较大，与Blanco J E等[23]报道的致病性大肠埃希菌与健康禽群所分离到的菌株血清型基本一致，了解温州地区鸡致病性大肠埃希菌优势血清型对于合理用药和疫苗研制有重要参考作用。

本研究结果显示，温州地区鸡肠道大肠埃希菌血清型众多，耐药率高，多重耐药问题严重，能在一定程度上反映出本地区养殖场抗菌药物使用不规范。后续应定期监测大肠埃希菌耐药性情况，根据监测结果，及时调整用药方案，指导疾病防控，以减缓耐药性的发展和传播。

[1] Harry E G，Hemsley L A.The association between the presence of sepicaemia strains ofEscherichiacoliin the respiratory and intestinal tracts of chickens and the occurrence of coli septicaemia[J].Vet Rec，1965，77:35-40.

[2] Saif Y M.禽病学[M].12版.苏敬良，高 福，索 勋,译.北京：中国农业出版社，2012:811-822.

[3] Al-Ghamdi M S， El-Morsy Z H，Al-Mustafa Z H，et al.Antibiotic resistance ofEscherichiacoliisolated from poultry workers,patients and chicken in the eastern province of Saudi Arabia[J].Trop Med Int Health，1999,4(4):278-283

[4] van den Bogaard A E，Driession N L C，Stobberingh E E.Antibiotic resistance of faecalEscherichiacoliin poultry，poultry farmers and poultry slaughters[J].J Antimicrob Chemoth，2001,47:763-771.

[5] Hirsh D C，ManLachlan N J，Walker R L.兽医微生物学[M].2版. 王凤阳，范泉水,译.北京：科学出版社，2007:54-90.

[6] 陈东科，孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M].北京：人民卫生出版社，2011：314-319.

[7] Committee for Clinical Laboratory Standard.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；26th edition[S].Wayne,PA:CLSI,2016.

[8] 展天松，李军朝，邹宇靖，等．动物源性大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性及其耐药基因的检测[J]．畜牧与兽医，2016，48(10): 94-97.

[9] 林 雅，简燕娟，方志超，等.48株大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶基因型检测[J].中国兽医杂志，2016,52(1)：100-102.

[10] 刘保光，肖尚修，吴 华，等.鸭大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶的检测及药物敏感性分析[J].中国畜牧兽医，2010，37(9)：188-191.

[11] 田国宝，王红宁，张安云，等.规模化猪场大肠杆菌β-内酰胺酶类药物耐药性检测及其超广谱β-内酰胺酶调查[J].中国预防兽医学报，2011,33(10):776-780.

[12] 刘聚祥，李宏娟，李占雷，等.我国部分地区鸡致病性大肠杆菌的耐药性检测与分析[J].河北农业大学学报，2007,30(5)：94-99.

[13] 朱力军.动物大肠杆菌耐药性的变化趋势[J].中国兽药杂志,2001,35(2):16-18.

[14] Wallmann J，Schroter K，Wieler H，et al.National antibiotic resistance monitoring in veterinary pathogens from sick food-producing animals:the German programme and results from the 2001 pilot study[J].Int J Antimicrob Agents,2003,22( 4):420-428.

[15] Salisbury J G，Nicholls T J，Lammerding A M,et al.A risk analysis framework for the long-term management of antibiotic resistance in food-producing animals[J].Int J Antimicrob Ag ents,2002,20(3):153-164.

[16] 张燕飞，王 东，王玉炯，等.宁夏部分地区鸡大肠埃希菌的分离与血清型鉴定[J].动物医学进展，2012,33(5)：119-121.

[17] 丁伯良，鄢明华.天津地区鸡致病性大肠埃希菌血清型分布及其优势血清型的外膜蛋白型研究[J].动物医学进展，2003，24(2):94-96.

[18] 李先磊，吕点点，刘立超，等.湖南省岳阳市鸡源性大肠埃希菌血清型鉴定[J].安徽农学科学，2009，37(26):12590-12591.

[19] 吴华俊，任 文，周梅霞，等．扬州地区鸡病原性大肠埃希菌的分离与鉴定[J].现代农业科技,2009(15):306-307.

[20] 马兴树，朱美霞，王 斌，等．河北省南部鸡肝周炎大肠埃希菌的分离及血清型鉴定[J].中国农学通报，2009,25(1):12-16.

[21] 杨 斌，王传禹，杨向东，等.云南省鸡致病性大肠埃希菌的血清型鉴定及药敏试验[J].云南畜牧兽医，2010(3)：2-4.

[22] 李 冰，唐 峰，马鸣潇.锦州地区鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国农学通报，2011，27(29):38-41.

[23] Blanco J E，Blanco M，Mora A，et al.Serotypes ofEscherichiacoliisolated from septicaemic chickens in Galicia (northwest Spain)[J].Vet Microbiol，1998,61:229-235.

DrugResistanceandSerotypeIdentificationofIntestinalEscherichiacolifromChickeninWenzhou

HOU Feng-xiang1,LI Pei-de1,JIN Jun-jie1,JIN Da-chun1,CHEN Pu-yan2

(1.CollegeofAnimalSciences,WenzhouVocationalCollegeofScience&Technology,Wenzhou,Zhejiang,325006,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210095,China)

To investigate the drug resistance and serotype of chicken intestinalEscherichiacoliin Wenzhou，355 cloaca swab samples were collected from 27 chicken farms in Wenzhou,346Escherichiacolistrains were isolated and identified through germiculture and biochemistry experiments,and the percentage of isolation was 97.46%.Among 346 isolates ofEscherichiacoli，84.39%(292/346) isolates showed resistance to more than three antimicrobial drugs.Multiple resistance to antimicrobial drugs was presented in the isolates ofEscherichiacolifrom healthy chickens.Thirteen O serotypes of were identified，of which serotypes of O138,O146,O136,O45 accounted for 39.02%(135/346) and were the prevalent serotypes.

chicken;Escherichiacoli; drug resistance; serotype

2017-02-12

温州市公益性科技计划项目(N20140038)；温州市2015年农业丰收计划项目；温州市瓯海区科技发展计划项目(N20150307)

侯凤香(1982-)，女，山东郓城人，硕士，讲师，主要从事动物传染病学研究。

S852.612

B

1007-5038(2017)10-0114-04