原花青素对动脉粥样硬化模型家兔MMP-9表达的影响

梁景岩，陈 露，潘 阳，袁婷婷，张雨蒙，徐文华，何凯明，杨天立，王英歌

(1.扬州大学医学院基础医学与医学技术系，江苏扬州 225001；2.扬州大学医学院临床医学系，江苏扬州 225001)

原花青素对动脉粥样硬化模型家兔MMP-9表达的影响

梁景岩1，陈 露1，潘 阳2，袁婷婷1，张雨蒙2，徐文华2，何凯明2，杨天立2，王英歌2

(1.扬州大学医学院基础医学与医学技术系，江苏扬州 225001；2.扬州大学医学院临床医学系，江苏扬州 225001)

探讨原花青素对家兔动脉粥样硬化模型基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。将24只新西兰白兔随机分为对照组(n=8)、模型组(n=8)和原花青素组(n=8)。模型组给予高脂日粮，原花青素组在模型组的基础上加用原花青素。采集试验前及喂食12周后试验兔的耳缘静脉血，检测静脉血中血脂水平的变化，观察主动脉病理形态学变化情况，用免疫组织化学方法检测MMP-9的表达。结果显示，在高脂日粮喂养的模型组中MMP-9表达明显升高，主动脉的病理形态学变化严重；而原花青素组主动脉病变明显减轻， MMP-9蛋白表达明显下降(P<0．05)。表明原花青素对于动脉粥样硬化的发展具有抑制作用，这一作用可能是通过抑制MMP-9的表达来实现。

原花青素；动脉粥样硬化；基质金属蛋白酶-9;家兔

动脉硬化是动脉的一种非炎症病变。男性较女性多，其发病趋势严峻，是老年人死亡主要原因之一。动脉硬化病人多有脂代谢异常。动脉粥样硬化斑块的形成是导致动脉血管狭窄和闭塞的主要病理过程；同时也是血管壁慢性炎症的结果。在此过程中，金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9， MMP-9)的作用开始被人们所关注。有研究表明，过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)γ的活化对于动脉粥样硬化 (atherosclerosis，AS)反应能够起到抑制作用；MMP-9对AS斑块的形成过程具有促进作用[1]。

原花青素是一种天然抗氧化剂，作为一类生物类黄酮，清除人体内自由基功效显著[2]。其可溶于水，可广泛应用于降血脂、抗脂质过氧化、改善血液循环、预防白内障、降血压、滋润及美白皮肤等方面[3-5]。研究发现，原花青素在发挥强抗氧化功能的同时，对于人体微循环特殊改善和清除自由基等方面有重要作用[6]。现代药理学表明，原花青素抑制AS的发生可通过降脂、改善血管内皮功能的途径实现。为了验证原花青素是否通过影响 MMP-9的表达来干扰AS的发生，本研究通过喂养高脂日粮的方法来建立AS新西兰白兔模型，通过原花青素的干预治疗来观察MMP-9的表达情况，以期为进一步完善原花青素对AS防治的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雌性新西兰白兔24只，9周龄，体重1.5 kg～2 kg,扬州大学医学院提供。高脂日粮：普通混合饲料(88.5%)、猪油(10%)、胆固醇(1%)、猪胆盐(0.5%)。单笼喂养，温度在22℃～25℃之间，相对湿度50%～60%。

1.2 方法

1.2.1 试验分组及模型构建 将经过适应性喂养的24只新西兰白兔随机分为对照组、模型组、原花青素组3个组，每组8只。对照组饲喂普通饲料每天160 g/只，模型组饲喂高脂饲料160 g/d，原花青素组每天饲喂高脂饲料160 g/d+原花青素1 g/kg，喂养至第12周末。采集所有试验兔耳缘静脉血，检测其血清中甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，同时对主动脉进行X线检查。若TC、TG偏高，HDL偏低，且X线检查可见主动脉伸长、扩张和扭曲，有时可见钙质沉着，则可确定该试验兔动脉粥样硬化造模成功。

1.2.2 采集血清标本 于12周末采集所有试验兔空腹耳缘静脉血6 mL，注入不含抗凝剂的试管中，标本静置后离心分离血清。用于测定血脂中各指标(TC、TG、LDL-C、HDL-C)、MMP-9的水平。

1.2.3 动物处死及标本留取 在12周末，通过往试验兔耳缘静脉推注空气的方法将其处死。剖检出主动脉，剥除外膜结缔组织及脂肪，选取其中的降主动脉，冲洗，用950 mL/L乙醇固定；获取标本，用于免疫组化检测及光镜观察病理形态学变化。

1.2.4 病理形态学观察 将兔降主动脉标本置于950 mL/L乙醇固定过夜之后，冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋，将初步处理好的组织经修整后切成厚度为4 μm的切片，放入45℃温水中展开，随后，将切片放在56℃温箱中2 h左右；再通过HE和免疫组化染色观察其形态变化。免疫组化染色的阳性标记物：棕色反应物，其平均灰度值借助细胞浆染色的方法获取。

2 结果

2.1 血脂水平变化

试验前各组试验兔的血脂水平没有显著差异，试验后，通过对比观察发现，模型组TG增高不如其他指标明显，而与正常对照组相比，TC、HDL-C、LDL-C等指标均明显升高(P<0.05)。经过原花青素干预后的原花青素组，与模型组比较，TG变化不明显，而TC、LDL-C、HDL-C等指标均有降低，具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2 病理形态学情况

通过HE染色观察发现，对照组血管表现为内皮光滑,内皮细胞完整、排列整齐；中膜平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)排列整齐。模型组血管内膜内皮细胞缺失严重，内膜增厚明显，含大量泡沫细胞，脂质沉积等；中膜SMC增殖，排列紊乱。原花青素组内膜增厚不明显，泡沫细胞的含量少；中膜SMC排列比较整齐(图1)。

表1 3组兔血脂指标的比较Table 1 Comparison of blood lipid indexes of three groups of rabbits

注：*与对照组相比，P<0.05;#与，与模型组相比，P<0.05。
Note:*Compared with the control group,P<0.05;#Compared with the model group,P<0.05.

A.对照组;B.模型组;C.原花青素组A.Control group;B.Model group;C.Proanthocyanidins group图1 HE染色观察各组主动脉病理形态Fig.1 HE staining to observe the aortic histopathological lesions

2.3 MMP-9的表达情况

免疫组化检测发现， MMP-9的棕色反应物位于胞浆上，对照组棕色反应物的表达量较少。模型组表达增多明显，在内膜靠近中膜处表现的尤为突出，呈棕黄色或棕褐色；原花青素组表达降低明显，着色程度降低(图2)。与对照组比较发现，模型组和原花青素组MMP-9表达水平有明显差异 (P<0.05)；模型组和原花青素组相比，原花青素组的MMP-9表达明显降低，统计学差异明显(P<0.05)(表2)。

A.对照组;B.模型组;C.原花青素组A.Control group;B.Model group;C.Proanthocyanidins group图2 免疫组化观察主动脉MMP-9表达在组间变化情况Fig.2 The changes of aortic MMP-9 expressions observed by immunohistochemistry in three groups

表2 金属蛋白酶(MMP-9)的灰度值表达情况Table 2 The expression of matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) by calculating the gray value

注：*与对照组相比，P<0.05;#与，与模型组相比，P<0.05。
Note:*Compared with the control group,P<0.05;#Compared with the model group,P<0.05.

3 讨 论

AS的主要病理基础是血管内皮细胞损伤、脂质的沉积、内皮细胞的增殖、泡沫细胞的出现以及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖和迁移，最后导致了粥样斑块形成。其中的一个关键性因素是由于VSMC增殖和迁移[7]。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor-b，PDGF-B)对动脉中膜收缩型SMC具有促进作用，可以使其迁移到内膜下层时，转化为分泌型SMC，参与粥样斑块的形成过程，是最有力的促有丝分裂原[8-9]；在此过程中通过分泌大量的活性物质来促使细胞黏附，同时这些活性物质也具有强烈的缩血管作用。MMP-9能够将SMC从基底膜中释放出来，对VSMC基底膜基质具有分解作用，进一步导致VSMC的移行，对AS发生和发展至关重要[10]。AS的重要防御因子之一是血浆血脂中的HDL-C，而血浆中血脂主要成分包括TC、TG、HDL-C和LDL-C，对于AS的发生发展具有很明显的抑制作用，对于AS的消退也具有明显的作用。本研究发现，模型组和原花青素组的新西兰白兔血脂各指标均明显高于对照组；模型组在AS形成过程中存在血脂代谢紊乱，并且在3个组中最为严重；原花青素组血脂的各项指标(TG、TC、LDL-C)明显低于模型组，而HDL-C水平明显高于模型组，提示原花青素能够通过改善血脂代谢来抑制AS形成。基质金属蛋白酶的主要功能是降解细胞外基质，对SMC从中膜迁移至内膜起到至关重要的作用[11]。由于MMP-9的主要功能是降解纤维中的基质，因而在提升斑块的易脆性和削弱斑块的纤维帽这方面起到一定的作用，从而引起了斑块破裂、血栓形成等后果，然而给予一定量的MMP-9抑制剂，能够在AS的发展以及新生内膜的形成等过程中起到一定的抑制作用[12]。MMP-9是MMP家族中重要成员之一，它的重要作用主要体现在VSMC迁移、基质降解、AS形成和加速斑块破裂，主要功能是降解弹力纤维和Ⅳ型胶原[13]。通过本次试验发现，MMP-9蛋白在对照组的表达明显低于模型组；与模型组相比，原花青素组MMP-9蛋白表达明显减轻，提示原花青素能降低 MMP-9蛋白的表达水平，从而对SMC从中膜向内膜迁移的过程起到抑制作用；与抑制VSMC向内膜迁移的MMP-9抑制剂效果一致[14]。

本研究发现原花青素能够抑制MMP-9的表达是通过改善血脂代谢来实现，通过抑制SMC对VSMC基底膜基质的分解，从而起到防治AS的作用，表明原花青素抗AS疗效的可靠性，本研究从分子生物学角度探讨了原花青素抗AS机制，为探讨MMP-9对AS的作用机制提供了进一步的理论依据。

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EffectsofProanthocyanidinsonExpressionsofMMP-9inaRabbitModelofAtherosclerosis

LIANG Jing-yan1,CHEN Lu1,PAN Yang2,YUAN Ting-ting1,ZHANG YU-meng2,XU Wen-hua2,HE Kai-ming2,YANG Tian-li2,WANG Ying-ge2

(1.DepartmentofBasicMedicineandMedicalTechnology,YangzhouUniversitySchoolofMedicine,Yangzhou,Jiangsu,225001,China;2.DepartmentofClinicalMedicine,YangzhouUniversitySchoolofMedicine,Yangzhou,Jiangsu,225001,China)

To study the effects of proanthocyanidins on the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in rabbits with atherosclerosis,twenty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups: control group (n=8),model group (n=8) and proanthocyanidins group (n=8).The model group was fed with the high-cholesterol diet,and the proanthocyanidins group that were on the basis of the model group were fed with proanthocyanidins.The changes of blood lipid in venous blood were analyzed before the experiment and at the 12th weeks of feeding; the changes of aortic pathological lesions were observed and the expression of MMP-9 was detected by immunohistochemistry.The expression of MMP-9 was significantly increased in the model group with high-cholesterol diet,and corresponding pathological lesions of aorta were serious.However,the expression of MMP-9 was significantly decreased in the proanthocyanidins group (P<0.05),beside,the aortic pathological lesions were improved.Proanthocyanidins have an inhibitory effect on the development of atherosclerosis,and this effect may be achieved by inhibiting the expression of MMP-9.

proanthocyanidins;atherosclerosis;matrix metalloproteinase-9；rabbit

2017-03-07

国家自然科学基金 (81570392);国家重点研发计划项目(2016YFE0126000)

梁景岩(1977-)，男，黑龙江黑河人 ，博士 ，讲师 ，主要从事动脉粥样硬化研究。

S852.31;S853.74

A

1007-5038(2017)10-0088-04