黄芪总黄酮对大鼠佐剂性关节炎病理损伤的影响

刘馨宇，徐 璐，王 娜，孙玉海，李金霞，张 瑜，王 莹，张雪梅*

(1.延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 133002；2.吉林省龙井市畜牧站， 吉林龙井 133400；3.吉林省龙井市老头沟镇畜牧兽医站，吉林龙井 133400)

黄芪总黄酮对大鼠佐剂性关节炎病理损伤的影响

刘馨宇1，徐 璐1，王 娜2，孙玉海3，李金霞1，张 瑜1，王 莹1，张雪梅1*

(1.延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 133002；2.吉林省龙井市畜牧站， 吉林龙井 133400；3.吉林省龙井市老头沟镇畜牧兽医站，吉林龙井 133400)

采用弗氏完全佐剂建立大鼠佐剂性关节炎(AA)模型，研究黄芪总黄酮(TFA)对AA大鼠关节组织病理损伤的保护作用。取36只大鼠随机分为6组，即空白组,模型组,阳性组,黄芪总黄酮高、中、低剂量组，除空白组外，其余各组大鼠右后足趾皮内注射含弗氏完全佐剂的卡介苗(10 mg/mL)0.1 mL，建立AA模型。次日，各组灌胃相应药物，连续28 d，同时测定大鼠足趾肿胀度和关节炎指数；第29天将大鼠处死，HE染色观察大鼠踝关节滑膜组织及软骨组织的病理组织学变化；免疫组化法观察大鼠滑膜和软骨细胞 NF-κB p65的表达。结果表明，TFA能明显降低大鼠原发性足趾肿胀度及多发性关节炎指数；TFA能减轻AA大鼠踝关节炎性细胞浸润及滑膜增生，减少血管翳生成；TFA能抑制NF-κB p65的高表达。说明 TFA对AA大鼠的病理损伤有潜在的保护作用。

黄芪总黄酮；大鼠；佐剂性关节炎；病理损伤；NF-κB p65

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以损害滑膜、软骨和骨的一种慢性、炎症性自身免疫疾病[1]。RA动物模型中使用最广泛的是佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)模型和胶原诱导的关节炎(Type Ⅱ collagen induced arthritis,CIA)模型[2]。佐剂性关节炎又称弗氏佐剂性关节炎，是建立免疫性关节炎动物模型的基本方法。其病理特征主要表现为滑膜下的组织炎症，滑膜增生，形成血管翳并破坏软骨，最终造成不可逆的关节损害[3]。

黄芪(Astragalus)作为传统中药材，具有免疫调节、利尿、保肝、降压、抗病毒等功效。现代药学研究表明，黄芪含有多种活性成分，包括黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮类成分等[4]。研究表明，黄酮类化合物具有保护心脑血管、利胆保肝、清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗过敏、抗炎症、抗病毒等多种生物活性及药理作用[5]。黄芪总黄酮(total flavonoids ofAstragalus，TFA)为黄芪的主要活性成分之一，本实验室已有的研究表明，黄芪总黄酮能够降低AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL的分泌，并上调血清中OPG的分泌及OPG/RANKL[6]，但对佐剂性关节炎大鼠关节组织病理损伤的保护作用还未报道，本试验旨在研究黄芪总黄酮在病理组织学方面对大鼠佐剂性关节炎保护作用，为阐明黄芪的药理作用和进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠，雄性，体重220 g±20 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.1.2 药物 黄芪总黄酮，南京泽朗生物公司产品(纯度98%)；甲氨喋呤(MTX)，上海信谊药厂有限公司产品，批号 H4102005。

1.1.3 试剂及药品 弗氏完全佐剂，Sigma公司产品；卡介苗，上海生物制品研究所产品，批号20070425；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，TCI化成工业发展有限公司产品；一抗NF-κB p65，Cell Signaling Technology公司产品；通用型二步法检测试剂盒、浓缩型DAB试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立、分组及给药 雄性Wistar大鼠36只，随机分为6组，空白组,模型组,阳性组及TFA高、中、低剂量组。适应性喂养1周后，除空白组外，其余5组大鼠于右后足垫皮内免疫卡介苗浓度为10 mg/mL的弗氏完全佐剂0.1 mL建立AA模型。正常组大鼠后足垫皮内注射生理盐水。于次日开始灌胃，TFA高、中、低剂量组分别灌胃100、50、25 mg/kg TFA，1次/d，阳性组灌胃3 mg/kg甲氨蝶呤，2次/周，连续28 d。空白组、模型组灌胃相同体积的5 g/L CMC-Na溶液。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 一般状态观察 观察各组大鼠试验期间的精神状态、被毛、采食、饮水、运动情况等。

1.2.2.2 大鼠原发性足趾肿胀度的测定 从0 d起，使用足趾容积测量仪测量右后肢的容积，每4 d测量1次，直至28 d，计算4、8、12、16、20、24、28 d的足趾肿胀度。

1.2.2.3 大鼠多发性关节炎指数评分 通过外表观察对AA模型大鼠进行评分，方法与评分标准均参照文献[7]。评分标准为：0正常；1轻度炎症；2中度炎症；3重度炎症。具体方法：除右后肢爪部外，对其他三肢爪部进行关节炎指数的评分，其余三肢出现肿胀变形至少评分为1；耳朵有一个红斑或结节至少评分为1；鼻周围结缔组织肿胀至少评分为1；眼睛有云翳生成至少评分为1。从给药16 d起，每2 d观察1次，计算关节炎指数。

1.2.2.4 大鼠踝关节病理组织学检查 第29天，将大鼠用乙醚麻醉，脱颈处死，取双侧踝关节组织，放入中性甲醛中固定5 d，取出再放入100 g/L的EDTA脱钙液中，室温脱钙30 d，每3 d更换1次脱钙液。取部分脱钙后的踝关节组织，做石蜡切片，HE染色。显微镜下观察踝关节滑膜、软骨和骨质等病理学变化。

1.2.2.5 免疫组化法检测滑膜组织NF-κB p65蛋白表达 取石蜡切片，按照通用型二步法检测试剂盒和浓缩型DAB试剂盒说明书进行操作，检测大鼠踝关节组织中NF-κB p65蛋白的表达。

2 结果

2.1 黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠一般状态的影响

正常组大鼠被毛色泽光亮，动作敏捷，采食饮水无变化，关节活动自如，身体和精神状态良好。模型组大鼠在免疫佐剂后，自主活动减少、关节运动障碍，足底局部出现红肿，后期整只爪和关节肿胀，足底和足垫部出现溃疡后,破溃结痂。最初表现为足肿胀，而后向上到达踝关节，关节部位皮肤发红水肿，温度升高。TFA高、中、低剂量组及阳性组给药后精神状态有所好转，关节肿胀度、足底足垫部溃疡有不同程度的缓解。

2.2 黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠原发性足趾肿胀度的影响

由表1可见，与空白组相比，模型组在4、8、12、16、20、24、28 d时能极显著升高大鼠原发性足趾肿胀度(P<0.01)。与模型组比较，TFA高剂量组在4 d时能显著降低大鼠原发性足趾肿胀度(P<0.05)，在8、12、16、20、24、28 d能极显著降低大鼠原发性足趾肿胀度(P<0.01)。TFA中剂量组在12、24、28 d能显著降低大鼠原发性足趾肿胀度(P<0.05)，在16、20 d能极显著降低大鼠原发性足趾肿胀度(P<0.01)。TFA低剂量组在16、20、24、28 d能显著降低大鼠原发性足趾肿胀度(P<0.05)。结果表明,TFA能减轻AA大鼠的原发性足肿胀程度，且呈一定的量效关系。

2.3 黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠多发性关节炎指数评分

造模后16 d，除空白组外,各组大鼠开始出现全身症状，表现为未免疫佐剂的其余三肢出现关节红肿、变形，耳部出现红斑，鼻结缔组织肿胀，眼睛有云翳生成，运动功能障碍。由表2可见，与空白组相比，模型组在16、18、20、22、24、26、28 d 时均存在极显著差异(P<0.01)。与模型组比较，TFA高剂量组在16 d～28 d期间均可以极显著降低AA大鼠关节炎指数(P<0.01)；TFA中剂量组在16、18 d时可以显著降低AA大鼠关节炎指数(P<0.05)，在20、22、24、26、28 d可极显著降低AA大鼠关节炎指数。TFA低剂量组只在26、28 d显著降低AA大鼠的关节炎指数(P<0.05)。结果表明， TFA能够显著抑制AA大鼠的关节炎的指数，且呈一定的量效关系。

2.4 黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠踝关节组织病理变化的影响

各组大鼠踝关节HE染色后镜检发现，正常组滑膜有微量炎性细胞浸润，滑膜由单层滑膜细胞组成，排列规则，关节面光滑，关节腔内无渗出，滑膜纤维组织疏松(图1A)。模型组关节病变主要为滑膜出现弥漫炎性细胞浸润和大量的血管翳，滑膜细胞层数增加，滑膜纤维组织增生明显，滑膜向关节腔内生长，关节软骨出现侵蚀破坏(图1B)。TFA高、中、低剂量组可减轻AA大鼠踝关节滑膜细胞和组织增生，以及骨和软骨侵蚀破坏情况，减少炎性细胞浸润和血管翳形成(图1C、D、E)。

表1 黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠原发性足趾肿胀度的影响Table 1 Effect of TFA on primary swelling of feet in rats with adjuvant arthritis

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
Note:Compared with control group,##P<0.01;Compared with model group,*P<0.05，**P<0.01.

表2 黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠多发性关节炎指数评分Table 2 Effect of TFA on polyarthritis index in rats with adjuvant arthritis

注：与空白组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。
Note: Compared with control group,##P<0.01; Compared with model group,*P<0.05，**P<0.01.

A.正常对照组；B.模型组；C.TFA高剂量组；D.TFA中剂量组；E.TFA低剂量组；F.阳性组
A.Control group；B.Model group；C.TFA High dose group；D.TFA Mid dose group；E.TFA Low dose group；F.Positive group
图1黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠踝关节组织病理变化的影响(HE，100×)
Fig.1 Effect of TFA on histopathological lesions of ankle joint in rats with adjuvant arthritis (HE，100×)

2.5 黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织NF-κB p65蛋白表达的影响

免疫组化结果见图2。 NF-κB p65蛋白在镜下观察，出现棕黄色颗粒沉着为阳性反应。与空白组比较，可见模型组滑膜细胞NF-κB p65高表达(图2 B)；与模型组比较，可见TFA高、中、低剂量组均能抑制滑膜细胞中NF-κB p65的过量表达(图2C、D、E)。

A.正常对照组；B.模型组；C.TFA高剂量组；D.TFA中剂量组；E.TFA低剂量组；F.阳性组
A.Control group； B.Model group； C.TFA High dose group； D.TFA Mid dose group； E.TFA Low dose group； F.Positive group
图2黄芪总黄酮对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织NF-κB p65蛋白表达的影响(IHC，100×)
Fig.2 Effect of TFA on NF-κB p65 protein expression in synovial tissue of rats with adjuvant arthritis (IHC，100×)

3 讨论

弗氏佐剂诱导的关节炎大鼠模型是临床研究常用的实验动物模型。由于AA大鼠模型测试时间短、容易被复制、病理过程可控，与人的类风湿性关节炎相似，因此，此模型常用于评估具有潜在抗关节炎活性较高的药物[7]。在AA大鼠中，足肿胀的测定和多发性关节炎指数评分是简单、敏感和快速的指标，用于评估炎症程度和评估药物的治疗效果[8]。在本试验中，AA模型组大鼠多个关节肿胀发炎，肿胀程度较重。TFA能减轻AA大鼠的原发性足肿胀程度并抑制继发性炎症。表明TFA对AA大鼠的关节组织有一定的保护作用。

RA最基本的病理变化是滑膜增生，炎性细胞浸润，血管翳形成。滑膜增生发生在RA发病的早期过程，会出现滑膜组织增厚，关节粘连等病理改变，是RA病理过程的最直接反应[9]。血管翳是高度吻合的血管侵入关节软骨和骨，血管翳的形成预示着RA病情加重，血管翳大量进入关节腔，引起关节活动异常、关节疼痛和组织损伤，血管翳侵蚀关节，引起骨侵蚀、软骨破坏、关节融合以致骨化，血管翳生成被认为是一个促进RA慢性关节损伤的重要机制[10]。本试验对各组大鼠踝关节HE染色后，镜检发现TFA高、中、低剂量组可不同程度的减轻AA大鼠踝关节滑膜细胞和组织增生、骨及软骨侵蚀破坏情况，减少炎性细胞浸润和血管翳形成。

有研究表明，在培养的滑膜细胞和RA患者滑膜组织中检测出磷酸化的NF-κB p65，在关节炎动物模型也证明NF-κB p65在RA的发生发展过程中具有举足轻重的作用[11-12]。同时NF-κB p65是一个促炎症基因表达的重要调节因子，合成的促炎症因子有TNF-α、IL-1β和PGE2 等。因此，NF-κB p65表达的失衡在滑膜病变中起到非常重要作用，并与RA发病机理相关。在本试验中，采用免疫组化法检测滑膜组织中NF-κB p65表达情况可知，模型组滑膜组织中NF-κB p65高表达，TFA高、中、低剂量组可以不同程度的降低NF-κB p65的表达。

综上所述，本研究表明TFA通过下调AA模型大鼠关节肿胀度、多发性关节炎指数，减轻滑膜增生、减少炎性细胞和血管翳形成，抑制AA大鼠滑膜组织中NF-κB p65蛋白表达，从而对大鼠佐剂性关节炎病理损伤起到保护作用，为TFA治疗佐剂性关节炎提供依据。

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EffectsofTotalFlavonoidsofAstragalusonPathologicalLesionsinRatswithAdjuvantArthritis

LIU Xin-yu1,XU Lu1,WANG Na2,SUN Yu-hai3,LI Jin-xia1,ZHANG Yu1,WANG Ying1,ZHANG Xue-mei1

(1.DepartmentofAnimalMedicine,AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,Yanji,Jilin,133000,China;2.AnimalHusbandryStationinLongjingCityofJilinProvince,Longjing,Jilin,133400,China;3.AnimalHusbandryandVeterinaryStationinLaotougouTownofLongjingCity,Longjing,Jilin,133400,China)

The model of adjuvant arthritis in rats was established by Freund's complete adjuvant,and protective effects of total flavonoids ofAstragalus(TFA) on the pathological lesions of articular cartilage in rats with adjuvant arthritis were studied.The 36 rats were randomly divided into 6 groups:the control group,model group,positive group and the TFA high,mid and low dose groups.Excepting for the control group,the rats were intradermally injected Freund's complete adjuvant 0.1 mL of 10 mg/mL BCG for establishing adjuvant arthritis model.In the second day,the rats in every group were intragastrically administrated with corresponding drugs for 28 days.Meantime,the primary swelling of feet was measured and the arthritis indices were observed.On 29 day,the rats were killed and the histopathological lesions of synovial tissue ankle joints were observed by HE staining.Immunohistochemical method was used to observe the expression of NF-κB p65 in synovial membranes and chondrocytes of rats.The results showed that TFA could obviously reduce primary swelling of feet and multiple arthritis indices of rats.Histopathological examination indicated that TFA could reduce obviously the inflammatory cell infiltration,synovial hyperplasia and the pannus formation in AA rats.Immunohistochemistry results showed that the expression of NF-κB p65 was inhibited by TFA.The results suggest that TFA has potential protective effect on the pathological lesions of AA in rats.

total flavonoids ofAstragalus;rat;adjuvant arthritis;pathological lesion;NF-κB p65

2017-01-18

国家自然科学基金项目(31660727,31260622，31060349)；吉林省科技厅重点科技攻关项目(20160204016NY)

刘馨宇(1992-)，女，吉林白山人，硕士研究生，主要从事兽医药理学与毒理学研究。*

S853.74;S857.165

A

1007-5038(2017)10-0073-05