迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠溃疡性结肠炎的保护作用研究

胡还甫，宋旭日，刘 刚

(岳阳职业技术学院/洞庭湖特色中药材综合利用重点实验室，湖南岳阳 414000)

迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠溃疡性结肠炎的保护作用研究

胡还甫，宋旭日*，刘 刚

(岳阳职业技术学院/洞庭湖特色中药材综合利用重点实验室，湖南岳阳 414000)

为研究迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠溃疡性结肠炎的保护作用机制，采用DSS建立大鼠溃疡性结肠炎模型，各组分别给予低、中、高剂量的迷迭香乙酸乙酯萃取物，连续给药2周，检测TLR4、TNF-α、MD2、IL-13、IL-8、IL-10水平及结肠组织病理学变化。结果显示，迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高剂量能明显降低TLR4、TNF-α、MD2、IL-8水平，提升IL-13、IL-10水平(P<0.05)，改善大鼠溃疡性结肠模型结肠病理改变。说明迷迭香乙酸乙酯萃取物对溃疡性结肠炎具有明显的保护作用。

迷迭香；乙酸乙酯萃取物；溃疡性结肠炎

迷迭香(Rosmarinusofficinalis)具有抑菌、抗病毒、抗氧化等作用[1]，现多用于药品、食用香料、食品加工和化妆品等领域。为验证迷迭香的抗炎抑菌作用，本研究采用硫酸葡聚糖造模致大鼠溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)，检测用药前后相关抗体和炎性因子的变化，以研究迷迭香乙酸乙酯萃取物对UC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 迷迭香干品，来自平江蓝海迷迭香专业种植合作社;阳性对照药,柳氮磺吡啶肠溶片,批号：150102，上海中西三维药业有限公司产品。

1.1.2 试剂 硫酸葡聚糖(分子质量36 ku～50 ku),美国MP Biomedicals公司产品；TLR4抗体，上海沪尚生物科技有限公司产品； MD2抗体，上海星科生物科技有限公司产品；TNF-α、IL-13、IL-8、IL-10 ELSIA试剂盒，北京泰泽瑞达科技有限公司产品；批号：20150813。

1.1.3 实验动物 SPF级雄性大鼠130只，体重245 g～260 g，饲养在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境，动物合格证号：№4304701649。实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2016—0004；实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2016—0006。

1.1.4 仪器 FA2005A型分析天平，上海精天公司产品；Bio-Rad imark型酶标仪，美国Bio-Rad公司产品；UV-Power PC型紫外/可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器有限公司产品；BX51型生物显微镜，Olympus有限公司产品；RM2245型半自动切片机,TP1020型全自动脱水机,KD-BM型组织包埋机。

1.2 方法

1.2.1 迷迭香乙酸乙酯萃取物 取迷迭香干品，粉碎、过筛后以950 mL/L乙醇回流提取3次(5、4、3 h)，活性炭脱色后过滤，得乙醇粗提物。将乙醇提取物用石油醚脱脂后，再用乙酸乙酯进行萃取、浓缩，即得到乙酸乙酯萃取物[1]。然后将乙酸乙酯萃取物用950 mL/L乙醇分别配制成0.2、0.4、0.8 g/mL的溶液。阳性对照药：柳氮磺吡啶肠溶片，研细，加蒸馏水制成0.054 g/mL的混悬液。

1.2.2 造模与分组 取SPF级SD雄性大鼠130只，体重245 g～260 g，取20只大鼠作为空白对照组。其他大鼠采用20 g/L硫酸葡聚糖(DSS)溶液灌胃7 d，再饮用纯净水恢复7 d，诱导成UC大鼠模型。按体重随机分成5组，分别为模型对照组、柳氮磺吡啶组、迷迭香乙酸乙酯萃取物低、中、高剂量组，每组20只，模型对照组和空白对照组给予10 mL/kg纯净水，其余组分别灌胃柳氮磺吡啶肠溶片混悬液10 mL/kg(阳性对照组)、迷迭香乙酸乙酯萃取物2 g/kg(低剂量组)、4 g/kg(中剂量组)、8 g/kg(高剂量组)剂量药液，连续灌胃2周，末次给药后，各组大鼠麻醉采血，备用。

1.2.3 检测方法 参考文怀宇等[2]的方法，采用免疫组化染色检测血清TLR4，ELSIA分别检测血清中TNF-α、MD2、IL-13、IL-8、IL-10的含量。取结肠组织，对结肠组织形态学和病理学评分，评分标准见表1[3](HS评分标准)。

1.2.4 统计学方法 通过SPSS16.0软件进行统计处理，采用单因素方差分析计量资料，非参数检验进行比较分析计数资料，各组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。

表1 结肠黏膜损伤及组织病理学评分标准Table 1 Colonic mucosa injury and histopathological grading standard

2 结果

2.1 迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠血清TNF-α、IL-13、IL-8、IL-10的影响

如表2，与空白对照组比较，模型组血清IL-13、IL-10水平明显降低，IL-8水平升高(P<0.05)。连续给药2周后，阳性对照组、迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高剂量能明显升高IL-13、IL-10水平(P<0.05)；阳性对照组、迷迭香乙酸乙酯萃取物高剂量组能明显降低血清TNF-α、IL-8水平(P<0.05)。

2.2 迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠血清TLR4、MD2的影响

如表3所示，与空白对照组比较，模型组血清TLR4、MD2水平显著升高(P<0.05)。连续给药2周后，阳性对照组、迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高剂量能明显降低TLR4水平(P<0.05)；阳性对照组、高剂量组能明显降低MD2水平(P<0.01)。

表2 迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠血清TNF-α、IL-13、IL-8、IL-10的影响Table 2 The effects of ethyl acetate extract of the Rosmarinus officinalis on TNF-α，IL-13,IL-8,IL-10 in rat sera

注：与空白对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，+P<0.05，++P<0.01。
Note：Compared to the blank control group，*P<0.05;Compared to the model group，+P<0.05，++P<0.01.

表3 迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠血清TLR4、MD2的影响Table 3 The effects of ethyl acetate extract of the Rosmarinus officinalis on TLR4，MD2 in rat sera

注：与空白对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，+P<0.05，++P<0.01。
Note：Compared to the blnk control group，*P<0.05;Compared to the model group，+P<0.05，++P<0.01.

2.3 迷迭香乙酸乙酯萃取物对结肠组织病理评分的影响

取各组大鼠结肠切片于显微镜下观察，结果空白对照组结肠表面比较光滑，无明显水肿、溃疡及异型增生(图1A)；模型组：大鼠结肠可见明显充血与水肿，有大量炎细胞浸润于黏膜层和黏膜下层，腺体结构模糊不清，可见大量溃疡点及隐窝肿坏死(图1B)；阳性对照组(图1C)、迷迭香乙酸乙酯萃取物低剂量组(图1D)、中剂量组(图1E)、高剂量组(图1F)结肠炎症逐渐出现不同程度的改善，结肠黏膜中性粒细胞浸润明显减少，高剂量组尤为明显，溃疡部分有愈合迹象。各组评分结果见表4，结果显示阳性对照组、迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高剂量组能明显改善大鼠溃疡性结肠炎症。

A.空白对照组；B.模型组；C.低剂量组；D.中剂量组；E.高剂量组；F.阳性对照组
A.Blank control group；B.Model group；C.Low dose group；D.Middle dose group；E.High dose group；F.Positive control group
图1大鼠溃疡性结肠炎结肠组织病理学检查(HE，200×)
Fig.1 The histopathological examination of UC in rats (HE，200×)

表4 迷迭香乙酸乙酯萃取物对大鼠溃疡性结肠炎结肠组织的影响Table 4 The effects of ethyl acetate extract of the Rosemary on UC tissue in rats

注：与空白对照组比较，**P<0.01;与模型组比较，+P<0.05。
Note：Compared to the blank control group，**P<0.01;Compared to the model group，+P<0.05.

3 讨论

溃疡性结肠炎(UC)是一种结肠黏膜的慢性非特异性炎性疾病，临床症状主要为血性腹泻，目前其作用机制尚不完全明确。免疫系统调节异常可能是UC发病的重要环节，主要表现为不能下调免疫激活所致的促炎细胞因子增高[4-5]。研究显示，活检组织和血清炎性因子水平高低与溃疡性结肠炎严重程度、累及范围及是否复发相关。TLR4、TNF-α、MD2、IL-13、IL-8、IL-10在UC的发生和病情发展中起着重要作用，TLR4是诱导内毒素/脂多糖(LPS)应答最主要的受体，在TLR4和相应配体结合后，可以促使各种炎性细胞因子基因表达的激活[6]。TLR4在MD2的配合参与下,可以介导LPS形成炎性反应。TNF-α是一种具多种生物活性的免疫调节与促炎症因子，由活化的单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生。TNF-α 可在炎症局部聚集白细胞，并与炎症细胞相互作用，最终导致结肠黏膜损伤[7]。IL-10 的主要生理功能是抑制促炎性细胞因子释放，从而抑制和终止炎症反应，能在调节肠道细胞平衡上起到关键作用。IL-13具有抗炎效应的-种多效性的Th2细胞因子，与整个机体免疫功能密切相关。研究发现，IL-13在血浆中浓度的改变与病变活动性以及UC的严重程度有关，随着UC炎性浸润的增加，IL-13的水平逐渐下降[8]。因此，IL-13可减轻肠黏膜的炎性反应。IL-8是中性粒细胞强有力的趋化因子，可聚集并激活中性粒细胞，使其释放溶菌酶，并促进溶菌酶的活性和吞噬效应，造成局部组织病理损害。上述的生物学活性与炎症反应密切相关，在炎症反应中起更直接的介导作用，故IL-8的异常往往导致一些免疫炎性疾病发生。

本研究显示，模型组TLR4、TNF-α、MD2、IL-8明显升高，IL-13、IL-10含量明显降低，提示它们与UC发病密切相关。阳性对照组(柳氮磺吡啶)和迷迭香乙酸乙酯萃取物中、高剂量组能明显降低大鼠溃疡性结肠炎TNF-α、TLR4、MD2、IL-8等炎性因子水平，提升IL-10、IL-13水平。并明显改善结肠组织病理状态。说明迷迭香乙酸乙酯萃取物可能是通过降低大鼠血清TLR4、MD2、IL-8炎性因子水平，降低炎性介质的释放，增加IL-13、IL-10的表达，减轻其分泌减少或活性降低而导致的炎性介质过量释放，间接调控失衡的细胞因子，从而减轻炎症反应，促进受损肠黏膜修复。

[1] 胡还甫.迷迭香电热杀菌消毒液制备及效果观察[J].亚太传统医药，2015，11 (21):22-23.

[2] 文怀宇，郑 爽，郎轶咏，等.灌肠散对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用研究[J].中南药学，2017，15(4)：443-447.

[3] 李 婷，朱向东，翟艳会，等.痛泻要方对溃疡性结肠炎模型大鼠血清 NPY、VIP 表达以及结肠组织病理的影响[J].中医学报，2017，4(32)：227-229.

[4] Lakatos L.Immunology of inflammatory bowel disease[J].Acta Physiol Hung，2014，887(4):355.

[5] Blumberg R S，Strober W.Prospects for research in inflammatory bowel disease[J].JAMA，2015，285(5):643.

[6] 韩 亮，刘昌辉．败酱草对溃疡性结肠炎大鼠结肠TNF-α，IL-1β及IL-10表达的干预作用[J].今日药学，2013，23(2)：78-80．

[7] 李 璟，王蔚虹，张鸿晨，等.幽门螺杆菌感染对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠慢性结肠炎的保护作用[J].解放军医学院学报.2017,38(7):65.

[8] 秦 谦，龚 豪，杨 洋，等.粪菌移植通过改善肠黏膜屏障功能治疗硫酸葡聚糖诱导的小鼠结肠炎[J].第三军医大学学报，2017，1(1)：1-5.

ProtectiveEffectofEthylAcetateExtractofRosmarinusofficinalisonUlcerativeColitisinRats

HU Huan-fu,SONG Xu-ri,LIU Gang

(KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationCharacteristicChineseHerbalMedicinesofDongtingLake,YueyangVocationalTechnicalCollege,Yueyang,Hunan,414000,China)

To study the protective effect of ethyl acetate extract ofRosmarinusofficinalison the model of ulcerative colitis, the model of ulcerative colitis was established by using DSS.The low,medium and high doses of ethyl acetate extracts ofRosmarinusofficinaliswere continuously administered to rats in each group for two weeks.The serum levels of TNF-α，IL-8 and histopathological lesions of colon were examined.The results showed that medium and high doses of ethyl acetate extracts ofRosmarinusofficinalissignificantly reduced TLR4, TNF-α,MD2,IL-8 levels，and increased IL-13,IL-10 (P<0.05),and decreased the pathological lesions of the colon of ulcerative colitis rat model.It demonstrated that ethyl acetate extract ofRosmarinusofficinalishad a significant protective effect on ulcerative the colitis model.

Rosmarinusofficinalis;ethyl acetate extract；Ulcerative colitis

2017-05-12

湖南省教育厅资助项目(14C1156，16C1637)

胡还甫(1978-)，男，湖北咸宁人，硕士研究生，讲师，主要从事中药学研究。*

S8523.74

A

1007-5038(2017)10-0069-04