2014—2016年全国草鱼出血病病原检测能力情况分析

景宏丽 李 清 李晓琳 王静波 林祥梅 张 旻 王 娜 吴绍强*

（1.中国检验检疫科学研究院 北京 100176；2.全国水产技术推广总站；3.北京市水产技术推广站）

2014—2016年全国草鱼出血病病原检测能力情况分析

景宏丽1李 清2李晓琳1王静波3林祥梅1张 旻1王 娜1吴绍强1*

（1.中国检验检疫科学研究院 北京 100176；2.全国水产技术推广总站；3.北京市水产技术推广站）

为了进一步加强水生动物防疫系统实验室能力建设，提升水生动物疫病检测水平，推动实验室能力认证认可，建立和完善实验室考核管理机制，2014—2016年农业部全国水产技术推广总站委托中国检验检疫科学研究院组织开展了草鱼出血病病原检测能力验证项目。3年参试实验室共计69家次，满意结果从53%上升到88%。结果表明，通过3年测试，全国草鱼出血病病原检测能力提升较快，为该病的诊断与防控提供了技术支撑。

草鱼出血病；病原；检测能力；分析

1 前言

草鱼呼肠孤病毒（Grassp Carp Reovirus，GCRV）是中国分离到的第一株鱼类病毒，是草鱼出血病的病原[1]。GCRV为20面体的球形颗粒，直径70～80 nm，具有双层衣壳，无囊膜[2，3]。病毒基因组为双股RNA，由11条片段组成[4]。草鱼出血病的特点为流行范围广，发病季节长，发病率高，死亡率可达80%以上，对草鱼养殖业和进出口贸易造成了巨大威胁。据不完全统计，每年由于草鱼出血病导致的经济损失达21.36亿元[5-7]。2008年，草鱼出血病在《一、二、三类动物疫病病种名录》中被列为二类疫病，同时农业部的鱼类苗种管理办法中要求检测草鱼出血病，有些国家如韩国在从中国进口草鱼等一些鲤科鱼类时也要求检测草鱼出血病。

为了预防和控制草鱼出血病的流行，对该病进行流行病学监测和诊断十分必要。因此，对GCRV检测的能力及水平进行评估，有利于国内相关单位对草鱼出血病的暴发进行及时监测、预防和控制，也是保证国内水产养殖业健康发展并促进出口贸易的有效手段。尽管目前已经建立了一些相关检测方法[8-11]，也研制了相关的疫苗并获得显著成效[12]，但是该病在中国部分地区仍然有局部流行。相关实验室对GCRV的检测水平，是保障水产养殖业、避免该病暴发的重要技术支撑，因此，开展关于GCRV检测能力验证项目具有重要意义。通过开展该项目，可以全面了解各有关实验室在检测GCRV的技术水平，掌握实验室间差异；了解参加的实验室的检测能力能否满足GCRV检测的国家标准或行业标准的要求，帮助实验室发现在日常检测GCRV存在的问题，为提高实验室的检测水平提供依据，也为政府和其他相关单位在进一步控制和预防草鱼出血病方面提供有效数据。

2014—2016年，农业部全国水产技术推广总站每年都委托中国检验检疫科学研究院组织开展GCRV检测能力验证项目。本文主要是对3年的全国GCRV检测能力具体情况进行分析和总结，以期为草鱼出血病防治、监测工作提供基础材料。

2 2014—2106年全国GCRV检测能力验证项目

2.1 参试实验室情况

2014年，第1次测试时报名参加实验室14家，在对结果不满意参试实验室进行第2次测试时，有1家实验室（没有参加第1次测试）报名参加，所以实际参加实验室数目为15家；2015年，第1次测试时报名参加实验室21家，在对结果不满意参试实验室进行第2次测试时，有8家实验室（没有参加第1次测试）报名参加，所以实际参加实验室数目为29家；2016年，第1次测试时报名参加实验室24家，在对结果不满意参试实验室进行第2次测试时，有1家实验室（没有参加第1次测试）报名参加，所以实际参加实验室数目为25家；2014—2016年，实际参试实验室数目为69家次。每年参加实验室均覆盖了全国大部分草鱼养殖区域，具有一定的代表性，见表1。

表1 2014—2016年参试实验室情况

2.2 样品制备情况

2014年发放给实验室的样品有3种：含有活病毒的鱼内脏组织样品、正常鱼内脏组织样品、含有病毒核酸片段质粒的鱼内脏组织样品；2015年的样品增加到4种，增加了干扰病毒样品（其他水生动物病毒）；2016年又恢复为3种样品，与2014年的样品相同。每次能力测试中所有样品均进行了均一性和稳定性检测：均一性实验为每类样品一次性制备100管，随机抽取3管进行检测，结果显示制备的样品均一性比较好。稳定性实验，为了保证病毒活性，模拟了4℃和25℃两个温度，每个温度样品分别放置5d和7d，结果显示制备的样品在25℃、7d能保持较好的稳定性。以上结果表明，所有制备样品能够满足能力测试中对样品的各项要求。

2.3 发样情况

2014年有3种样品，每个参试实验室收到3份盲样，其中仅有1份阳性；2015年有4种样品，4份盲样中仅有1份阳性，此外，应部分实验室要求提供了阳性参考物质，所以 2015年有5个样品管子；2016年，3种不同类型的样品，随机抽取组合，每个参试实验室收到4份盲样，其中可能含有0到4份阳性。每次能力测试的所有样品，用快递方式运输到各个参试实验室，一般3d左右到达各个参试实验室。具体见图1。

图1 2014—2016年发样情况

2.4 检测方法

2014年没有指定具体方法，2015年和2016年指定检测方法，根据SN/T 3584-2013《草鱼出血病检疫技术规范》[13]。该方法要求先对样品用敏感细胞系分离病毒，再用RT-PCR或者其他检测方法对分离物进行鉴定。

2.5 结果

2014—2016年，每年GCRV检测能力测试项目中，均向参试实验室进行两次发样，即第1次测试发样的对象为报名参加能力测试项目的参试实验室；第2次测试发样的对象不仅包括第1次测试结果为不满意再次报名参加的参试实验室，还包括没有报名参加第1次测试，直接报名参加第2次测试的参试实验室。具体结果如下：

2014年，第1次测试发样实验室14家，满意实验室5家，不满意实验室9家，满意率35%；第2次测试发样实验室5家 （其中第1次测试结果为不满意实验室中再次参加测试4家，首次报名参加实验室1家），满意实验室3家，不满意实验室2家，满意率60%。综合结果显示，2014年全国GCRV检测能力验证项目中，实际参试实验室15家，满意实验室8家，不满意实验室7家，满意率53%（表2）。

2015年，第1次测试发样实验室21家，满意实验室11家，不满意实验室10家，满意率52%；第2次测试发样实验室17家（其中第1次测试结果为不满意实验室中再次参加测试9家，首次报名参加实验室8家），满意实验室13家，不满意实验室4家，满意率76%。综合结果显示，2015年全国GCRV检测能力验证项目中，实际参试实验室29家，满意实验室24家，不满意实验室5家，满意率83%（表2）。

2016年，第1次测试发样实验室24家，满意实验室17家，不满意实验室7家，满意率71%；第2次测试发样实验室7家 （其中第1次测试结果为不满意实验室中再次参加测试6家，首次报名参加实验室1家），满意实验室5家，不满意实验室2家，满意率71%。综合结果显示，2016年全国GCRV检测能力验证项目中，实际参试实验室25家，满意实验室22家，不满意实验室3家，满意率88%（表2）。

表2 参试实验室结果统计

3 技术分析和建议

3.1 样品设计分析

2014年，3类样品，每个参试实验室收到3个盲样，预期结果仅有1个阳性。具体为：设计含有活病毒的鱼内脏组织样品为阳性，鱼内脏组织样品为阴性，其目的是为了保证参试实验室能够使用正确方法进行检测样品，即先通过细胞分离后，使用分子生物学方法或者免疫学方法进行检测。设计含有病毒核酸片段质粒的鱼内脏组织样品是为了发现有些实验室不做病毒分离而仅仅靠PCR结果来推测结果的行为。

考虑到2014年能力验证中，多数参试实验室最大问题是不能准确识别GCRV产生的细胞病变效应，所以在2015年的样品设计方面，增加了1个干扰病毒的样品，以期参试实验室能够通过观察不同病毒产生的不同细胞病变效应，来准确认识GCRV产生的细胞病变效应。

2016年虽然只有3种样品，但每个参试实验室会收到4份盲样，其中可能有0～4个阳性样品。这样做是考虑到2014年和2015年，能力测试结果均为仅有1个阳性，容易使参试实验室形成固定思维，即做出1个样品为阳性后，就自然认为其他样品一定是阴性。2016年的样品设计，更能够考察参试实验室的真实检测水平。

3.2 样品制备分析

每次能力验证发送样品的编号均为随机编号，有效地防止了参试实验室间的数据串通，保证了检测结果的可靠性和公正性。在样品稳定性测试中，选择5d和 7d，主要是根据组织单位承担过多次国家认证认可监督委员会组织的能力验证项目的经验，通过快递方式3～4d左右均能到各个参试实验室。选择5d和7d是为了在发生特殊情况，如因天气原因延迟送达等，保证样品质量不受影响。

3.3 检测方法分析

2014年，为了真实反映全国各个实验室在GCRV检测能力整体情况，在能力验证过程中，没有设定具体的检测方法。结果显示，15家参试实验室中，有10家采用了现行的行业标准（即先用敏感细胞系分离病毒，然后用分子生物学方法或者免疫学方法进行检测），剩下的5家仅仅使用了PCR方法进行检测。

为了能够使参试实验室在将来的检测或者监测计划中，对于样品检测能够有据可依，在2015年和2016年的能力测试中，要求各参试实验室必须采用指定的检测方法，即SN/T 3584-2013。结果显示，除了个别没有细胞系的实验室 （2015年有3家，2016年有1家）外，其他实验室均按规定使用了指定的检测方法。

3.4 参试实验室结果分析

3年的GCRV检测能力验证项目，从参试实验室数量和分布情况来看：2014年，对于GCRV检测能力验证项目，无论是组织单位还是参试实验室都是一次创新性的尝试，虽然参试实验室数目为15家，但其涵盖了包括广东省在内的10个省份直辖市，这些地区均为草鱼的重要养殖区域，结果具有一定的代表性。2015年，参试实验室数目为29家，涵盖了全国18个省份，相比2014年增加了14家；涵盖范围中缺少了新疆维吾尔自治区，但增加了9个省份，说明该次能力验证项目得到了全国相关单位的大力支持。2016年，参试实验室数目为25家，涵盖了全国16个省份，相比2014年增加了10家，涵盖范围中缺少了新疆维吾尔自治区，增加了7个省份；相比2015年减少了4家，涵盖范围缺少了福建省和黑龙江省。但从具体涵盖省份上看，2016年参试实验室范围依然涵盖了国内草鱼重要的养殖地区，参试实验室结果具有代表性，能够反映全国相关单位在GCRV检测方面的整体水平。

从各个参试实验室反馈结果来看，2014年第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果仅仅5家，满意率为35%，最终结果满意率为53%。这一结果表明在GCRV检测水平方面上，全国相关单位存在一定不足。2015年，第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果为11家，满意率为52%，比2014年第一次测试满意率增加了17个百分点，最终结果满意率为83%，比2014年最终结果满意率提高了30个百分点。说明经过2014年的能力测试项目，2015年的能力测试项目取得了较好的进展。2016年，第一次测试发样后，参试实验室获得满意结果为17家，满意率为71%，最终结果满意率为88%。对比2014年的能力测试，第一次测试发样满意率上升了36个百分点，最终结果满意率提高了35个百分点；对比2015年的能力测试，第一次测试发样满意率上升了19个百分点，最终结果满意率提高了5个百分点。说明经过2014和2015年两年能力测试项目，2016年的能力测试项目取得了突破性进展。

分析能力测试中获得结果为不满意的实验室的原因主要为以下两个方面：（1）忽略作业指导书的意义，没有按照规定时间内提交结果；（2）实验室操作人员，缺乏基本的操作知识或者技能，导致病毒样品失活或者是不能有效识别细胞病变效应。

总之，以上数据表明，2014—2016年，每年能力测试项目，都得到了全国重要养殖省份CGRV监测单位广泛支持，他们的结果具有代表性；通过3年的能力测试项目，参试实验室最终满意率从53%上升至88%，说明全国各个实验室在GCRV检测能力的整体水平方面得到了大幅度提升。

3.5 建议

（1）加强实验室人员操作技能培训

各个实验室是否能够具有GCRV的检测能力，不仅基于实验室基本的实验条件，更依赖于操作人员具备基本的实验技能。而人员的技能非短期内能够提高，其需要经过长期的培训积累才能获得。因此，建议加强参试实验室相关操作人员的技能培训。

（2）正确认识作业指导书的意义

为了保证GCRV检测能力验证项目的顺利进行，组织单位提供了作业指导书，其中明确了包括收到样品后的处理办法和提交结果日期等内容。在项目进行过程中，一部分参试实验室却忽略了作业指导书的意义，特别是忽略最终提交结果的时间。考虑到监测GCRV的技术支撑工作也对时效性具有严格要求，所以，建议参试实验室在参加能力验证项目过程中，认真读取、理解作业指导书的内容，按照规定日期提交相应结果，为将来承担相应的技术支撑工作奠定坚实基础。

（3）继续参加能力测试项目

2014—2016年连续3年的GCRV检测能力验证项目，结果表明，我国各个参试实验室在GCRV检测能力方面，获得了很大成效。但是各个参试实验室在能力测试过程还是有些不足，建议继续参加该项目的能力测试。其意义在于，一方面是对参试实验室本身能力的一个检验；另一个方面，也是参试实验室人员一个培训交流，提高自身操作技能的过程。

4 结论

2014—2016年，3年的能力验证中，由不指定检测方法到指定检测方法，规范了参试实验室检测标准。通过3年能力验证项目，使各参试实验室充分认识到在检测中不仅要结果准确，还要在有争议时，有理可说，有据可论。这对于承担监测任务的参试实验室不仅是能力的检验，更为监测任务的有效开展奠定了坚实基础。

能力验证的结果，除了2014年参试实验室是第一次参加此类能力验证项目，结果满意率稍低外，2015年和2016年，在参试实验室数量上和满意率上都有大幅度提高，特别是2016年第一次测试满意率为71%，综合结果满意率为88%。这些都表明2014—2016年，3年的GCRV检测能力验证项目取得了良好的效果，全面提升了水生动物防疫系统内实验室GCRV检测水平，极大推动了实验室能力认证认可，促进了实验室能力建设，为全国水生动物疫病防控工作提供了有力的技术支撑。

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[13]SN/T 3584-2013草鱼出血病检疫技术规范[S].

Analysis of Nationwide Proficiency Tests for GCRV in 2014-2016

JING Hongli1，LI Qing2，LI Xiaolin1，WANG Jingbo3，LIN Xiangmei1，ZHANG Min1，WANG Na1，WU Shaoqiang1*
（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100176；2.The National Fishery Technical Extension Centers；3.Beijing Aquaculture Technology Extension Station）

In order to further strengthendevelopment of laboratory capacity in the aquatic animal epidemic prevention system，improvedetection level of the aquatic animaldisease，promote the laboratory accreditation and certification ability，establish and perfect the management mechanism of laboratory examination，in 2014-2016，Chinese academy of inspection and quarantine was entrusted to carry out the proficiency test of grass carp hemorrhage pathogendetection capability by the national fishery technical extension centers.During the 3 years，test laboratory number totaled 69，and satisfactory results rose from 53%to 88%，the results show that through the 3 years of testing，the grass carp hemorrhage pathogendetection capability rapidly，which will provide technical support for thediagnosis and prevention of thedisease.

Hemorrhagic Disease of Grass Carp；Pathogen；Proficiency Test；Analysis

S851.34

E-mail：jinghongli8451@126.com；*通讯作者E-mail：sqwu@sina.com

“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD12B02）

2017-04-19