白芨中天然化合物的酶解法提取

吴威+赵天明+张振+张学俊+李雄

摘要：对白芨中的天然化合物进行酶解法提取，为其开发利用提供技术参考。以纯水、70%乙醇提取为对照，采用酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶对白芨块茎进行相继酶解，并对各提取物中的成分进行HPLC分析。酶解法与水提法、醇提法提取的白芨块茎中物质种类及含量存在明显差异。酶解法是比水提法和醇提法更为有效的白芨天然产物提取方法，所得提取的化学成分种类多，提取效率高。

关键词：白芨；天然化合物；酶解；HPLC；化学成分

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0175-04

别称白及，为兰科白芨属多年生草本植物[1]，其化学成分主要是联苄类（bibenzyls）、菲类（phenanthrenes）及其衍生物，如丁香树脂酚、β-谷甾醇、没食子酸等。此外，还有少量的挥发油、黏液质、白芨甘露聚糖（bletilla mannan）以及淀粉、葡萄糖等[2-4]。白芨具有收敛止血、消肿生肌、抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理功效，临床上广泛用于治疗出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、溃疡、烫灼伤等病，疗效显著[5-10]。另外，白芨中含有丰富的白芨多糖胶，在食品中可作为增稠剂；在化妆品等行业也有较好的应用[11-13]。

白芨天然产物的传统提取方法有水提取、有机溶剂提取法等，但有研究表明，纯水提取的物质相对有限，高温操作会引起热敏性有效成分的大量分解；有机溶剂提取物中残余溶剂不易除去，且成本相对较高[13]。然而，酶解法有其他传统方法达不到的优点，如反应条件温和，不破坏目标天然产物的化学结构，保持了其活性和药效；有效地破坏植物组织和细胞，有利于胞内外大量天然产物的溶出，提取效率高；原料无须粉碎，利于提取液过滤除杂和减少有效成分的损失等。目前尚未见到酶解法提取白芨的研究报道，本研究采用酸性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶相继对白芨块茎中的天然活性成分进行酶解提取，为中药白芨的进一步开发及应用提供技术参考。

1材料与方法

1.1试验材料

白芨，由贵州省农业科学院提供；酸性蛋白酶（50 000 U/g）、果胶酶（50 000 U/g）、纤维素酶（50 000 U/g），均购自张家港市金源生物化工有限公司；食品添加剂柠檬酸和柠檬酸钠，均购自潍坊英轩实业有限公司；无水乙醇（分析纯99.7%），购自天津市富宇精细化工有限公司；99.9%色谱纯乙腈，购自美国Tedia公司；色谱纯异丙醇，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，购自安捷伦公司；Eclipse Plus C18（3.5 μm，3.0 mm×100 mm），购自安捷伦公司；BSA224S电子分析天平，购自常州万泰天平仪器有限公司；UH-5300紫外可见分光光度计，购自天美（中国）科学仪器有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器，购自常州澳华仪器有限公司；RE-2000B旋转蒸发器，购自上海越众仪器设备有限公司；TGL 16M 凯特离心机，购自盐城市凯特实验仪器有限公司；SB-120D超声波清洗机，购自宁波新艺超声波设备有限公司；DZ-2BCII真空干燥箱，购自天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1白芨处理取干燥的白芨块茎，压成厚度为0.1～02 cm的裂制薄片，干燥环境遮光保存，待用。

1.3.2蛋白酶提取在4个编号为1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分別加入50 g白芨。将2 000 mL pH值为3.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液分4次与6 g酸性蛋白酶于500 mL烧杯中混合，4次洗脱后收集的酶解液合并，平均倒入4个三角瓶中，摇匀后置于54 ℃水浴摇床上同时同条件进行振荡，酶解终止时间分别为2、4、6、12 h。按时分别取出，抽滤后分别在旋转蒸发仪（60 ℃）上浓缩至15～20 mL，加入无水乙醇至终体积为50 mL并对应编号，趁热剧烈振荡混合充分后静置过夜，取上清液离心进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测分析，醇沉沉淀 45 ℃ 下进行真空干燥，并计算提取率。

1.3.3果胶酶提取待酸性蛋白酶提取完全后分别收集各时段三角瓶中所有白芨残余固体物继续进行果胶酶酶解。将2 000 mL pH值为3.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液分4次与6 g果胶酶于500 mL烧杯中混合，4次洗脱后收集的酶解液合并，平均倒入4个三角瓶中与白芨残余物混匀，置于 50 ℃ 水浴摇床上同时进行振荡，酶解时间及后续操作同“1.3.2”节。

1.3.4纤维素酶提取待果胶酶提取完全后分别收集滤纸上的残渣与瓶中剩余的白芨合并，继续进行纤维素酶提取。将2 000 mL pH值为5.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液分4次与6 g纤维素酶于500 mL的烧杯中混匀，4次洗脱后合并酶解液，平均倒入4个三角瓶中，置于50 ℃水浴摇床上同时进行振荡，酶解时间及后续操作同“1.3.2”节。

1.3.5纯水对照组于4个编号为1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分别加入50 g白芨。将2 000 mL纯水平均倒入这4个三角瓶中，摇匀后置于50 ℃水浴摇床上同时同条件进行振荡，提取时间及后续操作同“1.3.2”节。

1.3.6乙醇对照组于4个编号为1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分别加入50 g白芨。将2 000 mL 70%乙醇溶液平均倒入这4个三角瓶中，摇匀后置于50 ℃水浴摇床上同时同条件进行振荡，提取时间及后续操作同“1.3.2”节。

1.3.7HPLC测定方法测定样品为酸性蛋白酶提取物、果胶酶提取物、纤维素酶提取物，以及对照组纯水提取物和70%乙醇提取物。样品经0.45 μm的针头微孔滤膜注射入进样瓶中，进样量为10 μL，色谱柱为等径3.5 μm的Eclipse Plus C18反相柱，柱长100 mm，柱径3.0 mm，柱温40 ℃，梯度淋洗，流动相流速为0.45 mL/min，流动相A溶液为5%乙腈，流动相B溶液为95%乙腈，淋洗梯度：0～5 min，B溶液0 ～10%；5～10 min，B溶液10%～20%；10～30 min，B溶液 20%～30%；30～45 min，B溶液30%～60%；45～55 min，B溶液60%～100%。紫外检测波长为220 nm。endprint

2结果与分析

2.1提取物的吸光特性

取同时段等量的水提、醇提、酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶提取液合并混匀，离心取上清液，经稀释后于190～600 nm 范围内进行可见紫外吸收扫描。由图1可知，提取物的最大紫外吸收峰出现在220 nm处，也就是说白芨中在紫外线下有强吸收的物质在该坡长下几乎都能检测到。272 nm处也有1个紫外吸收峰，但在该处检测到的物质种类较少，为了对提取物组分进行较全面的检测，所以试验选取220 nm作为HPLC检测的波长。

2.2提取物的HPLC检测

在白芨植物组织中存在大量的具有高活性的天然化合物，而这些组织的生命活动是由于植物的各种生物酶的代谢及合成作用体现的，这些酶大多是蛋白质。利用蛋白酶可以降解白芨组织中的酶蛋白使组织内活性物质溶出。而植物很多组织之间的结合都是通过果胶质将它们黏接在一起的，经过蛋白酶的酶解会使这些果胶质充分暴露出来，再用果胶酶降解成为小分子成分，从而有助于细胞间果胶内的天然物质溶解出来，同时还会使植物细胞壁变得更为疏松，便于纤维素酶繼续酶解。植物细胞壁的主要成分是纤维素及少量的果胶类物质，这些物质的化学结构中含有大量的羟基，具有亲水疏油的性质，有机溶剂无法渗入细胞内，纤维素酶可针对性地降解细胞壁和细胞间质中的纤维素、半纤维素等成分，提高细胞膜的通透性，便于胞内的天然物质溶出[14-16]。

由于酶解白芨植物组织是两相生物化学反应，反应速度比化学反应慢，所以酶解提取天然产物的反应时间是影响生物活性物质提取效果的重要因素。本试验于不同时间下对白芨天然产物进行提取，并利用摇床进行振荡以加快反应速度，同时以纯水、70%乙醇提取作对照。

2.2.1酸性蛋白酶提取的化学成分由图2可知，酸性蛋白酶酶解提取的白芨物质种类较多，组成复杂。提取时间对提取的物质种类无影响，但对物质的含量影响较大。a峰物质的含量在提取2～6 h内逐渐增加，但在6 h后却略微下降；15～20 min溶出的物质含量随着酶解时间的增加而增大，尤其是b峰物质变化最明显；c、d峰物质的含量随着酶解时间的增加均有所下降，尤其是在6 h后下降趋势更明显。综合来看，6 h为酸性蛋白酶酶解提取白芨中天然化合物的最佳时间。另外，酸性蛋白酶对白芨组织的破坏作用常随着酶解时间的增加而增大，溶出的主要物质含量也增加，但长期的氧气接触或酶解作用都可能会引起某些物质的氧化或降解，而这种现象在随后的果胶酶和纤维素酶酶解过程中均存在。

2.2.2果胶酶提取的化学成分由图3可知，继酸性蛋白酶酶解后， 再用果胶酶酶解白芨剩余物时仍有大量的天然产物

溶出，其主要的物质种类和酸性蛋白酶相同，但物质含量却均有所下降，尤其是e、f、c、d峰物质。此外，果胶酶提取2 h时溶出了酸性蛋白酶提取物中没有的g峰物质，其含量较大，但随着提取时间的增加，其含量在逐渐下降，并在随后的纤维素酶提取物中不再出现，表明g峰物质主要存在黏连细胞的胞间果胶质中，同时也说明继蛋白酶酶解6 h后再用果胶酶酶解2 h，此时提取的物质种类较多，含量较大。

2.2.3纤维素酶提取的化学成分由图4可知，经酸性蛋白酶和果胶酶相继酶解后的剩余白芨固体再经纤维素酶酶解得到的物质成分显著减少，尤其是在酶解10 min后没有物质出现。经纤维素酶酶解仍有大量的a峰物质，说明a峰物质在细胞内外均大量存在。胞内的其他物质在纤维素酶提取物中均未得到，可能大多是一些亲水性物质，在酸性蛋白酶和果胶酶酶解过程中几乎均已水解溶出，再用纤维素酶酶解时，溶出的物质就极少。在纤维素酶酶解提取物中没有出现g峰物质，进一步说明g峰物质主要存在于黏连细胞的胞间果胶中。另外，随着提取时间的增加，a峰的峰面积明显下降，因此，经酸性蛋白酶和果胶酶相继酶解后，再用纤维素酶酶解提取白芨天然化合物的最佳时间为2 h。

2.2.4纯水提取的化学成分由图5可知，纯水提取的白芨化学成分种类较多，在13～22 min集中出峰明显且含量较大。在22 min后溶出的物质种类较少，含量也极低，可能主要是一些极性较小的亲脂性成分。提取时间对提取物质的种类无影响，但对物质的含量影响较大，表现为随着提取时间的增加，提取的物质含量也在增加，尤其是a峰和b峰。

2.2.570%乙醇提取的化学成分乙醇是提取中药有效成分常用的有机溶剂之一，常用于提取极性较小的化合物。采用适宜浓度的乙醇能提取亲脂性化合物和亲水性物质。

由图6可知，70%乙醇提取的白芨物质种类比纯水提取的物质种类丰富。在4～22 min内出现的物质种类和纯水提取的基本一致，但在22～50 min内出现的物质种类比水提取的丰富，含量也比水提取的大。表明在4～22 min内出现的物质主要以亲水性物质为主，22～50 min内溶出的除了纯水提取的物质外，还多了一些脂溶性物质。另外，提取时间为2、4、6、12 h时，提取的物质种类是相同的，但随着提取时间的增加，j、k等峰面积在6 h后下降明显，说明6 h为70%乙醇提取白芨天然产物的最佳时间。

2.2.6酶提与水提、醇提提取的化学成分比较由图7可知，从提取的物质种类上看，h、i峰物质主要存在于酸性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶提取物中，而在水提和醇提提取物中没有出现；c、d峰物质主要存在于酸性蛋白酶和果胶酶提取物中，在纤维素酶、水提、醇提提取物中没有出现；g峰物质是酸性蛋白酶、纤维素酶、水提、醇提提取均得不到的，而在果胶酶提取物中却大量存在，说明g峰主要存在于黏连细胞的胞间果胶中，只有通过果胶酶对胞间质的破坏才能使该物质溶出；另外，醇提取与水提取、酶提取相比较，在集中出峰的13～22 min 内溶出的物质种类大致是相同的，而在22～50 min内溶出的物质种类差异较大，醇提提取物中溶出的j、k等2种峰物质在水提和酶解提取物中没有出现，也就是说醇提取物中除了包含水提取的物质外，还提取出了一些脂溶性物质。综合看来，酶解提取物中h、i、c、d、g峰物质是水提和醇提均无法得到的。endprint

从提取的物质含量上看，a、e、m、f等4种峰物质在酶解、水提和醇提提取物中均大量存在，但物质含量却存在较大的差异。酸性蛋白酶提取6 h时，a峰的峰面积为纯水提取12 h的1.75倍，为醇提取6 h的2.7倍；e峰的峰面积为纯水提取12 h的1.5倍，为醇提取6 h的0.9倍；m峰的峰面积为纯水提取12 h的0.5倍，为醇提取6 h的0.5倍；f峰的峰面积为纯水提取12 h的0.9倍，为醇提取6 h的0.8倍。综合分析可知，利用酶法提取白芨天然化合物比水提取和70%乙醇提取更有效，提取的物质种类较多，提取效率高。

2.2.7酶解与水提法提取率的比较白芨块茎中含有大量的亲水性活性成分如白芨多糖胶等，采用水提-醇沉法可以大量获得，但往往含有蛋白质、淀粉等诸多杂质。而采用全酶法提取时，蛋白酶可以除去大量的蛋白质，低温可避免淀粉的糊化溶出。图8为不同时间下酶提（酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶相继提取）和水提3次后得到的醇沉干燥物提取量的比较，由图8可知，提取时间对物质的提取率影响较大，2种提取方法提取的物质量均在6 h时达到最大，6 h后逐渐下降；从提取效率上看，同等条件下酶解法的優势更明显，其提取率是纯水提取的3～5倍。

3结论

中药所含的化学成分十分复杂，既含有多种有效成分，又有无效成分，有些还包含有毒成分，提取其有效成分并进一步加以分离、纯化，得到有效单体是中药研究领域中的一项重要内容。好的提取方法能最大限度地提取其中的有效成分，提高中药制剂的内在质量和临床治疗效果，使中药的药效得以最大限度地发挥。本研究通过HPLC对酶提取、纯水提取、70%乙醇提取的白芨块茎中化学成分进行检测分析，结果表明，酶法提取物中的化学成分种类比纯水提取和醇提取丰富，且水溶性物质提取率较高，但对提取物中的化学成分鉴定还在进一步的研究中。另外，虽然酶解法对提取白芨中的天然化学成分有着较大的优势，但为发挥酶提取技术的最大优势，除了严格控制酶反应时间外，还须综合考虑酶解温度、pH值、底物的浓度、抵制剂和激动剂等酶反应条件对白芨提取效果的影响。

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