超声微创外科技术加速鼠正畸牙移动过程中microRNA以及组织蛋白酶K的表达

李岩　姚燕

【摘要】 目的：探讨在超声微创外科技术加速大鼠牙移动过程中组织蛋白酶K以及相关microRNA的表达改变。方法：将2月龄Wistar雄性大鼠60只按照随机分为空白对照组（对照组）、常规正畸治疗组（正畸组）和超声微创外科手术联合正畸治疗组（微创组）三组，每组20只。在正畸组中，大鼠上颌左侧第一磨牙与上切牙之间安装正畸装置，将磨牙以力值30 g的力量拉向近中移动；而微创组则为在正畸治疗的同时，在第一磨牙的近远中用超声骨刀切开骨皮质至骨髓质。每组于建立模型加力7 d時将大鼠处死，通过HE染色观察牙周组织的形态学变化并计数压力侧破骨细胞数目；通过Western blot检测牙周组织中组织蛋白酶K的表达改变；并通过实时定量PCR（Quantitative real time PCR，qRT-PCR）检测牙周组织中维持高表达的microRNA（miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155）的表达改变。结果：HE染色结果显示，与对照组相比，正畸组中牙周组织的形态发生明显病理学变化，并且大鼠压力侧破骨细胞数量明显高于对照组（P<0.05）。此外，正畸组中组织蛋白酶K的表达也出现明显上调，并伴随有牙周组织中miR-17、miR-21、miR-126、miR-32、miR-147、miR-155的表达紊乱（P<0.05）。但是在微创组中，牙周组织的形态、大鼠压力侧破骨细胞数量、组织蛋白酶K的表达及microRNA的表达紊乱均得到了改善（P<0.05）。结论：超声微创外科技术创伤小，术后肿痛轻，对牙周组织的影响小，能够加速正畸牙移动，适用于临床正畸治疗。

【关键词】 超声微创外科技术； 正畸治疗； 组织蛋白酶K； MicroRNA

Expression of MicroRNA and Cathepsin K in the Process of Accelerating Orthodontic Tooth Movement Through Ultrasonic Minimally Invasive Surgical Techniques in Rats/LI Yan，YAO Yan.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：016-020

【Abstract】 Objective：To explore the expression of cathepsin K and relevant microRNA in the process of accelerating orthodontic tooth movement through ultrasonic minimally invasive surgical techniques in rats.Method：A total of 60 Wistar male 2-month-old rats were divided into normal control group（the control group），orthodontic device group（the orthodontic group） and ultrasonic minimally invasive surgical techniques combined orthodontic treatment group（the minimally invasive group） according to random number table method，20 cases in each group.In the orthodontic group，the rats were installed orthodontic device between the left maxillary first molars and incisors，molars were pulled to the middle with the power of the force value 30 g.The minimally invasive group and the orthodontic group at the same operation，the cortical bone was penetrated to a depth of 0.5 mm mesially and distally in the first molar.The rats of each group were killedon the seventh day.The morphological changes of periodontal tissuewere observedvia HE staining and osteoclast number of the pressure side was counted.The expression of cathepsin K change of periodontal tissue was detected by Western blot and expression changes of high expression microRNA in periodontal tissue were detected through real-time Quantitative PCR，such as miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155.Result：Compared with the control group，HE staining results showed that periodontal tissue morphogenesis of the orthodontic group had obvious pathology change，and the osteoclast number of the pressure side was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.In addition，the orthodontic group also showed obviously up-regulated the expression of cathepsin K，and was accompanied by expression turbulence of miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155 in the periodontal tissue（P<0.05）.While in the minimally invasive group，the configuration of periodontal tissue，osteoclast number of pressure side，the expression of cathepsin K and microRNA expression disorders were improved（P<0.05）.Conclusion：Compared with conventional orthodontic method，ultrasonic minimally invasive surgical techniques wound is small，light postoperative sore，small impact on periodontal tissue，it can accelerate orthodontic tooth movement，so it may be suitable for clinical orthodontic treatment on the teeth.endprint

【Key words】 Ultrasound minimally invasive surgical techniques； Orthodontic treatment； Cathepsin K；MicroRNA

First-authors address：Liaocheng Peoples Hospital，Liaocheng 252000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.005

口腔正畸治療中牙齿的移动是一个牙周组织改建的过程，其受激素、生长因子、系统因素好的机械力等多种因素影响，是一个非常复杂的过程，其具体的分子生物学机制仍不清楚。并且如何加速正畸牙齿的移动，缩短治疗过程和保持正畸治疗后牙齿的稳定而理想的位置是治疗的关注重点。目前，超声微创外科技术治疗成为研究热点，该技术具有能够软硬组织识别、创伤小、恢复快等优点，能够有效的保护牙周膜细胞。

组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）主要存在于破骨细胞中，是一种半胱氨酸蛋白酶，其作用主要表现为降解骨连接素、胶原纤维等多种骨基质蛋白[1-2]。目前研究表明CTSK在破骨细胞中呈现高表达，与NF-κB受体活化剂配体，活化T细胞核因子，线粒体翻译起始因子等信号通路相互作用，增强破骨细胞形成和骨吸收[3-4]。此外，microRNA的研究是当前生物科学领域研究的热点之一，笔者选择牙周组织中高表达的六个microRNA、miR-17、miR-21、miR-126、miR-32、miR-147、miR-155等为研究对象，检测正畸治疗过程中牙周组织中microRNA的表达改变情况。

本文观察超声微创外科手术加速大鼠正畸牙移动以缩短治疗过程，并检测牙移动过程中组织蛋白酶K以及microRNA表达的改变，旨在探讨超声微创外科手术对牙周组织改建的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立 选取60只2月龄SPF级的Wistar雄性大鼠，体重200～220 g/只，并且通过口腔检测观察大鼠均牙列完整。大鼠均行10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠仰卧固定。选取左侧上颌为实验侧，以左上切牙为支抗，拉第一磨牙近中移动。使用牙科专用高速涡轮车针处理大鼠双侧上颌切牙，在其第一磨牙龈缘处构建固位沟，并同时准备0.25 mm的正畸专用不锈钢结扎丝，上颌切牙与第一磨牙之间将螺旋弹簧结扎，在第一磨牙的近远中用超声骨刀切开骨皮质至骨髓质，牵引左侧上颌第一磨牙向近中移动，力约30 g，持续7 d。

1.2 HE染色 于第7天时处死大鼠，解剖上颌骨并取得上颌第一磨牙以及牙周组织作为标本，用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，再用pH值为7.4的10%EDTA溶液脱钙50 d，用流水洗净脱钙液后使用不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水，再用二甲苯溶液进行组织的透明处理，最后使用石蜡包埋，送往医院病理科进行组织块的切片。对所得样本进行苏木素-伊红（HE）染色：首先，分别用二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）、二甲苯（Ⅲ）处理切片5 min，再用100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇以及70%乙醇各处理2 min，用流水冲洗5 min后，放入苏木精液中染色5 min，用流水冲洗去苏木精液，再放入1%的盐酸乙醇中快速处理3 s，用流水冲洗至切片返蓝，再用0.5%伊红液染色3 min，再用蒸馏水稍洗，再用80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇快速处理各2 s，再用二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）和二甲苯（Ⅲ）各处理2 min，最后用中性树胶封固，置于光学显微镜下观察。

1.3 microRNA的表达检测 使用Qiagen公司生产的miRNeasy Mini Kit试剂盒进行microRNA的提取，严格按照的产品说明书进行microRNA的富集。对所得到的microRNA进行反转录处理，反转录系统中包括反转录Buffer、RNA样本、MMLV反转录酶、dNTP、反转录引物以及RNA酶抑制剂，用DEPC水补齐至25 μL体系。反转录过程为为42 ℃ 50 min，70 ℃ 10 min，最后置于4 ℃。以cDNA为模板，进行实时定量PCR检测，所用的试剂盒购自北京全式金生物科技公司，严格按照说明书进行操作，最后在LightCycler Real Time PCR扩增仪进行检测。

1.4 Western blot检测PTEN的表达 先将牙周组织用组织匀浆机磨碎，再加入预冷的RIPA裂解液，震荡使其充分裂解后，加入上样缓冲液煮沸。进行SDS-PAGE电泳，待溴酚蓝染料迁移至底部时关闭电源，小心的将凝胶取出，并进行电转，将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维膜上，后将硝酸纤维膜置于脱脂牛奶封闭液中封闭1 h。再加入一抗（抗CTSK单克隆一抗购自Santa Cruz公司，货号：sc-48353），于4 ℃孵育过夜，用缓冲液冲洗硝酸纤维膜3遍后，然后在加入相应的二抗孵育1 h，用缓冲液冲洗硝酸纤维膜3遍后进行曝光检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用ANOVA单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠牙周组织形态及压力侧破骨细胞数量的变化 由HE染色结果可见，与对照组相比，正畸组中牙周组织形态（图1）发生明显改变，破骨细胞数量（图2）较多，并且体积稍大。然而在微创组中，牙周组织形态更偏向于对照组，并且破骨细胞数量较少，体积也略有减小。这说明微创外科技术对大鼠牙周组织形态改变较小，并且能够减少压力侧破骨细胞数量，提示微创外科技术正畸治疗疗效可能更好。

*与对照组比较，P<0.05

2.2 组织蛋白酶K表达的变化 通过免疫组织化学的方法检测牙周组织中组织蛋白酶K的表达丰度，与对照组相比，正畸组中组织蛋白酶K的表达明显升高；微创组组织蛋白酶K的水平较正畸组明显降低，见图3。为了确保实验数据的准确性，笔者使用组织匀浆器将牙周组织磨碎，每组中挑选任意两个样本，通过Western blot技术检测组织蛋白酶K的表达量，结果与免疫组化的结果一致，即正畸组中组织蛋白酶K表达较对照组高，而微创组中组织蛋白酶K表达较正畸组低，见图4。endprint

2.3 牙周组织中microRNA表达紊乱 本研究结果显示：与对照组相比，正畸组中几乎所有的microRNA表达均出现改变，其中miR-21和miR-126表达上调，上调最明显的是miR-21；miR-32和

miR-147的表达则未见明显改变（P>0.05）；另外两种microRNA，即miR-17和miR-155表达明显下调，其中miR-17的下降趨势最明显。然而在微创组中，几种microRNAs的表达趋势较正畸组有很大不同，但是有趣的一点是，几种microRNAs的表达谱与对照组有相似之处，比如微创组中miR-21的表达量较正畸组明显降低，回到对照组的表达水平；尽管微创组中miR-17的表达水平仍维持在较低的状态，但是与正畸组相比已经有了明显的升高。见图5。

图5 牙周组织中microRNA表达紊乱

2.4 生物信息学分析 众所周知，microRNA主要是通过与靶基因mRNA的3UTR区进行碱基互补配对，起到转录后的抑制作用。2.3已经介绍很多microRNAs的表达发生改变，但是它们的表达改变与组织蛋白酶K是否相关呢？笔者通过生物信息学分析，发生miR-17可能能够直接调控组织蛋白酶K。再结合以上两部分介绍，正畸组中组织蛋白酶K高表达伴随有miR-17的低表达，而微创组中组织蛋白酶K表达水平较正畸组降低，同时伴随有miR-17的表达升高。这都提示miR-17可能通过直接调控组织蛋白酶K来发挥对牙周细胞的生物学功能。

3 讨论

组织蛋白酶K是由前多肽原的复合体经加工后形成的一种成熟形式的单体蛋白质，骨吸收腔隙中的酸性环境有利于组织蛋白酶K的激活[5]。组织蛋白酶K是破骨细胞中高表达量的具有很强溶骨活性的半胱氨酸蛋白酶，能降解骨基质中的骨连接素和骨桥接素，是在骨吸收过程中发挥重要作用的关键酶[6]。

组织蛋白酶K在哺乳类动物的发育中发挥重要作用，该基因敲除小鼠中骨吸收功能缺陷，出现骨基质降解障碍的特征，导致骨硬化症等疾病。相反，组织蛋白酶K持续性高表达则会加速小鼠干骺端骨小梁的转换，引发骨质疏松症等疾病[7]。此外，血清中蛋白酶K水平与骨密度表现出一定的相关性，可以使用血清中蛋白酶K水平作为预测骨折风险的标志物[8-10]。很多证据都证明，组织蛋白酶K可以作为治疗骨吸收疾病的一个重要靶点。

最近研究证实，织织蛋白酶K在口腔临床中也有重要生物学作用，比如，组织蛋白酶K在乳恒牙的替换中发挥了重要作用。破骨和破牙细胞中，组织蛋白酶K能够发挥蛋白水解酶的功能，水解Ⅰ型胶原等骨基质蛋白，在破骨细胞以及破牙细胞的形成过程中发挥重要作用[11]。此外，根吸收现象，尤其是上前牙根吸收现象在几乎所有的正畸患者中普遍存在，牙根吸收会引起牙冠根比减小，降低稳定性，严重的甚至会引起牙齿松动脱落。正畸牙移动主要包括溶解矿化物和降解胶原纤维两个过程，而组织蛋白酶K主要发挥降解胶原纤维的作用，因此组织蛋白酶K在此过程中作用尤为重要[12]。本文发现组织蛋白酶K在正畸组和微创组中表达有差别，提示可能微创组对牙周组织的作用可能稍微小一些，这可能与治疗过程中破骨细胞和破牙细胞的数量等相关。

近年来，关于microRNA在生理以及病理状态中的功能研究越来越成为生命科学领域研究的热点。在成骨分化发生的第3、7、14天，miR-17的表达与在对照组出现明显降低[13-15]；miR-21则能够在拉力牵张介导的人牙周膜干细胞成骨诱导分化过程中发挥重要功能[16]；miR-155则在牙髓，牙龈和体外牙周膜细胞中呈现出组织依赖性的高表达[9，17-18]；在人患病牙周组织和健康的牙周组织中，miR-126，miR-32，miR-147和miR-155出现表达紊乱[19-20]。这提示microRNA可能参与了正畸治疗牙移动过程。通过qRT-PCR对几种microRNA表达改变的影响，肯定了miR-17和miR-21可能参与了该过程，并且生物学预测也显示miR-17可能参与了对组织蛋白酶K的调节。

本研究结果初步显示，与常规正畸方法相比，微创组中组织蛋白酶K表达水平较正畸组降低，同时伴随有miR-17的表达升高，这表明超声微创外科技术能够促进牙周组织改建，缩短牙周组织损伤的修复过程。其促进牙周组织改建的相关因子级联效应，有待于进一步探究。

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（收稿日期：2017-06-28） （本文編辑：邓朝阳）endprint