重组鸡GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡血清中Bax含量的影响

张 宁，李 桢，李娜娜，张旭华，张 靖，陈柳妃，宁官保，张 鼎，田文霞

（山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

重组鸡GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡血清中Bax含量的影响

张 宁，李 桢，李娜娜，张旭华，张 靖，陈柳妃，宁官保，张 鼎，田文霞

（山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

为研究谷胱甘肽硫转移酶A3（GSTA3）对胫骨软骨发育不良（TD）肉鸡血清中凋亡因子Bax的影响，试验将90羽1日龄AA肉仔鸡预饲7 d后，随机分为6组（A，B，C，D，E和F组），分别在8，9日龄对D，E，F组饲喂添加100 mg/kg福美双的日粮，将饲喂基础日粮组（A，B，C组）和添加福美双日粮组（D，E，F组）的肉鸡各分对照组（A，D组）、重组 GSTA3蛋白低剂量（20 μg/kg）注射组（B，E 组）和高剂量（50 μg/kg）注射组（C，F组），在试验第8，10，12天腿部肌肉注射重组GSTA3蛋白，对照组注射稀释用PBS。在饲喂福美双后第1，2，4天分别采集各组肉鸡血液、分离血清，利用ELISA方法测定肉鸡血清中Bax的含量。结果显示，低剂量的重组GSTA3蛋白显著降低第2天基础日粮（B）组肉鸡血清中Bax的浓度，同时显著降低第4天福美双处理（E）组肉鸡血清中Bax的浓度；高剂量的重组GSTA3蛋白显著降低第4天基础日粮（C）组和福美双处理（F）组肉鸡血清中Bax的浓度。低剂量的重组鸡GSTA3蛋白对降低TD肉鸡血清中Bax含量的效果较好，这一研究将为肉鸡TD的防治提供新的方向和研究基础。

肉鸡；胫骨软骨发育不良；重组鸡GSTA3蛋白；细胞凋亡；Bax

胫骨软骨发育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）是肉鸡常见的骨骼性疾病，以胫骨干骺端形成无血管的玉白色的“软骨楔”为特征[1-2]。肉鸡TD可导致机体抵御疾病能力下降，诱发多种疾病，降低肉品质，影响肉鸡养殖业的经济效益[3]。RATH等[4]采用TUNEL法研究表明，在10日龄TD症状不明显时，福美双诱导的肉鸡胫骨生长板的毛细血管内皮细胞发生凋亡，随后几天，毛细血管内皮细胞死亡增加，并伴随着生长板的过渡区软骨细胞的大量死亡。Bax（Bcl-2-associated Xprotein，Bax）是 Bcl-2家族中典型的促凋亡基因，主要分布于胞质中[5]，当接受凋亡信号刺激后，从胞质转移到线粒体膜上形成PT孔道，破坏线粒体膜的完整性，与Bcl-2形成异二聚体，或自身形成同源二聚体来抑制或促进Cyt-C的释放，从而调控细胞凋亡的发生[6-7]。谷胱甘肽硫转移酶A3（GSTA3）是GSTs家族成员，主要参与机体的解毒，以及与氧化应激相关的信号通路的调节。GSTA3能够降解某些化学物质的毒性，尤其是对致癌物质的毒性具有一定程度的降解作用[8]。用脂多糖（LPS）诱导人的PC12细胞建立神经元细胞模型，引发适应性反应，在亚致死浓度下，用LPS处理PC12细胞后，导致GSTA3基因表达及其他GSTs酶活性增加，显著高于未处理组。核因子红细胞2p45相关因子2（nuclear factor erythroid 2p45-related factor 2，Nrf2）由 LPS转录激活，Nrf2 小干扰RNA可以减弱GSTA3 mRNA水平的增加，以及LPS诱导的适应性应答。此外，外周注射LPS亚致死浓度，可以增加小鼠大脑中的GSTs活性。亚致死浓度的LPS可以刺激诱导适应性反应，并增强PC12细胞耐受性，主要是由于GSTA3诱导Nrf2信号转导通路的转录激活[9]。

本试验将重组GSTA3蛋白注射到肉鸡体内，以期探明重组GATA3蛋白对肉鸡血清中Bax含量的影响，为TD的缓解寻找新的防治方法。

1 材料和方法

1.1 试验动物

1日龄健康AA（艾维茵）肉仔鸡90羽，购自山西省文水县大象农牧集团有限公司。

1.2 试验试剂

福美双（JL131223002）购自美国Amresco公司；重组鸡GSTA3纯化蛋白为山西农业大学生物制品实验室自行制备；Bax酶联免疫检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；0.2，1.5 mL离心管购自美国Axygen公司。

1.3 试验方法

1.3.1 动物处理 试验参照田文霞等[10]和张建鹏[11]试验设计，将90羽肉雏鸡预饲7 d后，分为基础日粮组和福美双处理组，对福美双处理组肉鸡于8，9日龄通过添加100 mg/kg福美双诱发肉鸡建立TD模型，之后恢复基础日粮。并将具有活性的重组GSTA3蛋白分为低剂量（20 μg/kg）和高剂量（50 μg/kg）组，分别在第8，10，12天对基础日粮组和福美双处理组的肉鸡进行腿部肌肉注射，共分为6组：A组（空白对照）.饲喂基础日粮，腿部肌肉注射35 μg/kg的PBS，以达到相同的刺激；B组.饲喂基础日粮，腿部肌肉注射低剂量（20 μg/kg）重组GSTA3蛋白；C组.饲喂基础日粮，腿部肌肉注射高剂量（50 μg/kg）重组GSTA3蛋白；D组（对照）.添加福美双（100 mg/kg）日粮，腿部肌肉注射35 μg/kg的PBS，以达到相同的刺激；E组.添加福美双（100 mg/kg）日粮，腿部肌肉注射低剂量（20 μg/kg）重组 GSTA3蛋白；F 组.添加福美双（100 mg/kg）日粮，腿部肌肉注射高剂量（50 μg/kg）重组 GSTA3 蛋白。

1.3.2 样品采集 在福美双攻毒后的第1，2，4天每组随机挑选5只鸡，翅静脉采集血液，凝固后离心，收集上层血清，保存于-20℃，备用。

1.3.3 肉鸡血清中Bax含量的测定 肉鸡血清中Bax含量的测定采用竞争ELISA法，使用前先将试剂盒放置于室温平衡0.5 h以上，严格按照Bax酶联免疫检测试剂盒说明书操作步骤进行。

2 结果与分析

2.1 Bax标准曲线和回归方程

标准曲线如图 1所示。回归方程为：y＝（2.264－0.151）/（1＋（x/3.396）1.421）＋0.151 （R2＝0.996 09）。

2.2 样品血清中的Bax浓度

由图2分析得出，试验第1天，与空白对照A组相比，福美双对照D组肉鸡血清中Bax的浓度升高，但差异不显著，高剂量的重组GSTA3蛋白显著提高基础日粮组肉鸡血清中的浓度（P＜0.05）；与福美双对照D组相比，低剂量的重组GSTA3蛋白显著提高福美双处理组肉鸡血清中的浓度（P＜0.05）。

由图3分析得出，试验第2天，与空白对照A组相比，福美双对照D组肉鸡血清中Bax的浓度显著升高（P＜0.05），低剂量的重组GSTA3蛋白显著降低基础日粮组肉鸡血清中Bax的浓度（P＜0.05）；与福美双对照D组相比，低剂量的重组GSTA3蛋白降低福美双处理组肉鸡血清中Bax的浓度，但差异不显著。

由图4分析得出，试验第4天，与空白对照A组相比，福美双对照D组肉鸡血清中Bax的浓度显著升高（P＜0.05），高剂量的重组GSTA3蛋白显著降低基础日粮组肉鸡血清中Bax的浓度（P＜0.05）；与福美双对照D组相比，高剂量和低剂量的重组GSTA3蛋白显著降低福美双处理组肉鸡血清中 Bax的浓度（P＜0.05）。

3 讨论

GSTs主要参与细胞的2期解毒，细胞1期代谢产生的ROS和氧自由基一般为亲电子物质，细胞进入2期代谢以后，GSTs作为机体的解毒酶之一，可以通过催化GSH的硫原子、ROS、氧自由基以及其他异源产物发生亲核加成反应，生成更易于被清除的水溶性产物[12]。GSTs在防止脂质过氧化、修复DNA损伤以及对抗外界氧化应激、炎症反应和抗肿瘤形成等方面发挥着重要作用。细胞色素P450是一种1期代谢酶，广泛存在于机体多个脏器，能够催化体内多种反应，主要在肝脏进行。刘红霞等[13-14]研究发现，细胞色素P450能够减少外源化合物的毒性，可能是由于与GSTs共同发挥解毒作用，缓解了TD损伤。刘晶英[15]在基础饲粮中添加表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），结果显示，热休克蛋白HSP90基因和蛋白的表达量均出现下调，病变区软骨细胞的分化和血管生成能力得以恢复，EGCG还能够提高GSH的表达量和相关抗氧化酶的活性，能够有效减轻TD的症状。

Bcl-2家族成员是细胞凋亡的中枢细胞因子，因为它们形成了早期信号传导，使细胞进入凋亡过程，并且赋予细胞凋亡特征。Bax是Bcl-2家族中的主要促凋亡因子，长期以来，人们认为，从细胞质到线粒体的Bax易位是单向过程，但在非凋亡细胞中，Bax基本上在细胞溶质中扩散，而在细胞凋亡被引发后，其被重新定位到线粒体上[16]，以形成负责插入的寡聚体MOMP[17-18]。Bax的过表达不仅能诱导软骨细胞通过线粒体途径发生凋亡，而且可以促进多种因素诱导的多种细胞发生凋亡[19]。抗凋亡因子Bcl-2通过2种途径抑制Bax/Bak的活性，可以抑制与仅含BH3结构域的蛋白相互作用，或通过限制Bax/Bak自身结合的激活。因此，任何小分子抑制凋亡的有效性取决于阻断这2条途径的能力。一旦Bax和Bak被激活，它们经历一系列构象变化，便诱导凋亡[20]。本试验中，福美双诱导肉鸡TD发生后，在第1天福美双对照组肉鸡血清中Bax的浓度较空白对照组升高，但差异不显著，但在第2，4天，福美双对照组肉鸡血清中Bax的浓度显著升高。可能是由于福美双诱发TD后，在第1天对机体的影响不是太大，所以升高不明显，而第2，4天时，福美双所引起的毒性较强，肉鸡血清中Bax的浓度显著升高，则说明肉鸡胫骨生长板软骨细胞的凋亡程度增加。而第1天重组GSTA3蛋白并没有开始发挥解毒作用，导致福美双处理组与基础日粮组肉鸡血清中Bax的浓度并没有明显降低。低剂量的重组GSTA3蛋白显著降低第2天基础日粮组肉鸡血清中Bax的浓度，同时显著降低第2，4天福美双处理组肉鸡血清中Bax的浓度；高剂量的重组GSTA3蛋白显著降低第4天基础日粮组和福美双处理组肉鸡血清中Bax的浓度。这进一步说明，重组GSTA3蛋白可以通过一定的途径降低肉鸡血清中细胞凋亡通路中关键促凋亡因子Bax的浓度，进而缓解TD肉鸡胫骨生长板软骨细胞的凋亡程度，降低肉鸡TD引发的损伤。

4 结论

本研究结果表明，福美双诱导的TD肉鸡血清中Bax的含量显著升高，腿部肌肉注射高剂量和低剂量的重组鸡GSTA3蛋白可以显著降低基础日粮组和福美双处理组肉鸡血清中Bax的含量，且低剂量的重组鸡GSTA3蛋白对减少TD肉鸡血清中Bax的含量效果较好。

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Effect of Recombinant Broiler GSTA3 Protein on the Expression of Bax in Serum of TD Induced by Thiram

ZHANGNing，LI Zhen，LI Nana，ZHANGXuhua，ZHANGJing，CHENLiufei，NINGGuanbao，ZHANGDing，TIANWenxia
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To investigate the effect of glutathione S-transferase A3 （GSTA3）on the expression of apoptotic factor Bax in serum of tibial dyschondroplasia（TD）,the study used 90 one-day-old AA broilers were divided into 6（A,B,C,D,E and F）groups at random after basal-diet feeding for 7 days.D,E and F of above 6 groups were fed with diets containing 100 mg/kg of thiram at 8 and 9 days old.Subsequently,feedingbasal-diet（A,Band C）and addingthiramdiets（D,E and F）were divided intocontrol group（Aand D）,lowdose（20 μg/kg）injection group（B and E）and high dose（50 μg/kg）injection group（C and F）.The recombinant broiler protein GSTA3 was injected of leg intramuscularly at 8,10,12 days old,and the control group was injected with PBS for dilution.The blood collected after day 1,2 and 4 in TD broilers induced by thiram.The serum was isolated and the content of Bax was determined by ELISA.The results showed that the level ofBaxin serumofbroiler significantly decreased in basal-diet group（B）at 2 days and the level ofBax in serum of broiler significantly decreased in treated group（E）at 4 days because of the injection of lowdoses of GSTA3 recombinant protein（P＜0.05）.The level ofBaxin serumofbroiler significantlydecreased in basal-diet group（C）and treated group（F）at 4 days because ofthe injection ofhigh doses ofGSTA3 recombinant protein（P＜0.05）.Low-dose recombinant protein GSTA3 has a better effect on reducing Baxcontent in TDbroiler serum,and this studywill provide a newdirection and research basis for the prevention and treatment ofTD.

broiler;TD;recombinant chicken protein GSTA3;apoptosis;Bax

S831.1

A

1002-2481（2017）11-1849-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.28

2017-06-05

晋中市重点科技创新平台项目（P171002-3）；山西省回国留学人员科研资助项目（2017-073）；山西省科技攻关项目（20130311027-3）；2017年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（201710113001）；2017年山西省高等学校大学生创新创业训练计划项目（2017081）

张 宁（1990-），女，河南安阳人，在读硕士，研究方向：动物传染病发病与免疫机理。田文霞为通信作者。