雷公藤内酯酮抑制胃癌细胞恶性行为的作用与机理研究※

● 王振飞 贾永峰 牟永平 杨永燕 李景权

雷公藤内酯酮抑制胃癌细胞恶性行为的作用与机理研究※

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目的：观察雷公藤内酯酮对人胃癌细胞恶性行为的抑制作用，并初步探讨其作用机理。方法：CCK-8法检测雷公藤内酯酮对BGC 823胃癌细胞增殖能力的影响，软琼脂集落形成法检测雷公藤内酯酮对BGC 823细胞锚定非依赖性生长能力的影响，荧光定量PCR法检测雷公藤内酯酮对BGC 823细胞中piRNA651表达的影响。结果：雷公藤内酯酮显著地抑制了BGC 823细胞的增殖能力，IC50为165.17 nmol/L；当浓度等于或大于100 nmol/L时，雷公藤内酯酮有效地抑制了BGC 823细胞的锚定非依赖性生长能力；雷公藤内酯酮有力地下调了BGC 823细胞中piRNA651的表达。结论：雷公藤内酯酮可以降低胃癌细胞中促癌的非编码RNA的表达，使其恶性行为受到显著抑制，在胃癌的治疗上具有良好的应用价值。

雷公藤内酯酮 胃癌 增殖 锚定非依赖性生长 piRNA

我国是胃癌的高发国家，每年新发病例占全球的50%[1]。很多胃癌患者早期无明显症状，就诊时已处于中晚期，治疗以药物为主。常规化疗药物效果有限，毒副作用巨大，复发转移率高[2]。亟需开发出高效的、无毒的新型抗胃癌药物，以贡献于人类。

中国医药学博大精深，尤其在肿瘤治疗方面，经过几千年的临床实践，积累了丰富的经验，很值得深入发掘，加以提高。雷公藤是一味传统中药，味苦，性凉，有活血通络、破瘀镇痛之功效[3]。雷公藤内酯酮是从雷公藤中分离出的一种环氧二萜内酯化合物。动物实验表明，它在较高的剂量下对肝脏、肾脏等器官均无毒性作用[4]，也不会降低血液中红细胞、白细胞的数量[5]，显示出很高的安全性。以往对它的研究多集中于免疫抑制、抗炎和抗生育等方面[6，7]。对其抗肿瘤活性的报道甚少。本实验中，我们首次观察了雷公藤内酯酮对胃癌细胞增殖能力的影响，并从改变促癌的非编码小RNA表达的角度探讨了它的作用机理。

1 材料

1.1细胞株人胃癌细胞BGC 823购自中国科学院细胞库。

1.2试剂雷公藤内酯酮由陕西辰光生物技术有限公司提供，批号：20151125，纯度>98%，溶于二甲基亚砜(DMSO)，配成浓度为100mmol/L的贮存液。胎牛血清(10099133)、RPMI-1640培养液(11875093)、胰蛋白酶消化液(25200056)、DMSO(1572C502)均购自Gibco公司，CCK-8试剂盒(C16038)购自上海碧云天生物技术有限公司，低熔点琼脂糖(358608)购自santacruze公司，小RNA提取试剂盒EasyPure miRNA Kit(J21204)、miRNA反转录和荧光定量PCR试剂盒TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix(AQ202-01)均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3仪器二氧化碳恒温培养箱(Thermo)，超净工作台(苏州金燕)，倒置相差显微镜(Nikon TE2000)，多功能酶标仪SpectraMax i3x(Molecular Devices)，7500 Real-Time PCR Systems(Applied Biosystem)。

2 方法

2.1胃癌细胞的培养人胃癌细胞BGC 823培养于含10%胎牛血清、0.1%双抗的RPMI-1640培养基(完全RPMI-1640培养基)中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力将BGC 823细胞悬于完全RPMI-1640培养基中，调整浓度为2×104个/ml，接种于96孔板(0.2ml/孔)。培养24h后，药物组加入雷公藤内酯酮(终浓度为50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，对照组加入DMSO。继续培养48h，每孔加入CCK-8溶液20μl，培养箱内孵育1h。以450nm为检测波长、以650nm为参考波长，测定吸光度。计算相对增殖率(药物组吸光度/对照组吸光度)。

2.3软琼脂集落形成法检测细胞锚定非依赖性生长能力向6孔板每孔中加入1ml含0.6%低熔点琼脂糖的完全RPMI 1640培养液，摇匀后4℃静置5min。将104个细胞悬于0.5ml含0.3%低熔点琼脂糖的完全RPMI 1640培养液中，药物组加入雷公藤内酯酮(终浓度分别为50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，对照组加入DMSO，覆于底层琼脂糖之上。37℃、5%CO2培养3周，在显微镜下计大于100μm的集落数。

2.4荧光定量PCR法检测piRNA651表达水平BGC 823细胞传代培养24h后，药物组加入雷公藤内酯酮(终浓度分别为50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，对照组加入DMSO，作用48h后，使用EasyPure miRNA Kit 试剂盒提取RNA，使用TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 进行反转录和荧光定量PCR，操作按试剂盒说明书进行。荧光定量PCR条件为：94℃ 30s，(94℃ 5s，60℃ 34s)×40个循环。所用引物序列为：piRNA651上游引物5’-AGAGAGGGGCCCGTGCCTTG-3’，piRNA651下游引物Universal miRNA qPCR primer；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6下游引物Universal miRNA qPCR primer。以U6为内参，采用2-DDCt法计算piRNA651的相对表达量。

2.5统计分析使用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1雷公藤内酯酮抑制BGC 823细胞的增殖能力CCK-8 检测结果显示，雷公藤内酯酮对BGC 823 细胞的增殖能力具有显著的抑制作用，并呈明显的剂量依赖性，IC50为165.17nmol/L。见图1。

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2雷公藤内酯酮抑制BGC 823细胞的锚定非依赖性生长能力软琼脂集落形成实验显示，当浓度等于或大于100nmol/L时，雷公藤内酯酮对BGC 823细胞的锚定非依赖性生长能力具有显著的抑制作用，尤其当浓度达到250nmol/L时，BGC 823细胞生长形成集落的能力完全丧失。见表1。

表1 雷公藤内酯酮对BGC 823细胞锚定非依赖性生长能力的影响

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.3雷公藤内酯酮抑制BGC 823细胞中piRNA651的表达荧光定量PCR结果显示，雷公藤内酯酮对BGC 823细胞中piRNA651的表达具有显著的抑制作用。见表2。

表2 雷公藤内酯酮对BGC 823细胞中piRNA651表达的影响

注：与对照组相比，**P<0.01。

4 讨论

雷公藤为卫矛科雷公藤属一年生藤本植物，在祖国医学中有着悠久的药用历史，在临床上对多种肿瘤都显示了良好的治疗效果。但其严重的的毒副作用，限制了它在临床上的应用[8]。随着现代生物技术的提高，从雷公藤中分离纯化出了一系列单体，其中是否有抗肿瘤活性高、毒副作用低的单体，是一个值得深入研究的问题。已有的工作主要集中在雷公藤甲素和雷公藤红素[9，10]这两种物质上，发现它们虽有较好的抗肿瘤活性，但对肝脏、泌尿系统、生殖系统、消化系统、血液系统等会产生较大的毒性作用[11，12]。从雷公藤中分离出的雷公藤内酯酮，与雷公藤甲素和雷公藤红素的分子结构不同，所产生的药理作用也有差异。动物实验表明：它对肝脏、肾脏和血液系统均无毒性作用[4，5]。对于雷公藤内酯酮是否具有抗胃癌活性，迄今尚未见报道。本研究首次选用雷公藤内酯酮作用于胃癌细胞，发现它可以有效抑制胃癌细胞的增殖能力和锚定非依赖性生长能力，可以有力抑制胃癌细胞中促癌的非编码RNA的表达。这说明雷公藤内酯酮有望成为一种安全、高效的抗胃癌药物。

非编码RNA表达的异常是胃癌发生发展的一个重要原因。piRNA是近年新发现的一类非编码RNA，长度25-36个核苷酸，它们在调控转座因子活动、染色质完整性、DNA甲基化、mRNA稳定性等多个过程中发挥重要作用[13]。在肝癌[14]、胃癌[15]和乳腺癌[16]中，已发现一些piRNA的表达异常升高，使得抑癌基因启动子区发生超甲基化而引起转录失活，使得癌基因mRNA的降解受到抑制而增强其翻译活动，从而有力地促进了肿瘤的发生发展。已有研究证实：piRNA651在胃癌组织中处于高表达状态，极大地促进了胃癌细胞的增殖活动[15]。本研究发现，雷公藤内酯酮可以下调胃癌细胞中piRNA651的表达，这为阐明雷公藤的抗癌机理提供了一条新途径。

很多有抗肿瘤活性的中药，都有一定的毒副作用，使其在临床上的应用受到限制。但是，每味中药都是一个天然的化合物库，其中含有很多种活性物质，每种活性物质的毒性和药理作用是各不相同的，对它们进行细致的筛选，并加以针对性的研究，是可以寻找到低毒、甚至无毒，同时又有较好抗肿瘤活性的物质的，进而开发出属于我们中华民族自己的、具有独特疗效的抗肿瘤新药，造福于人类。

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国家自然科学基金(No.81760552)；内蒙古自然科学基金(No.2016MS0824)；内蒙古自治区高等学校创新团队发展计划(No.NMGIRT-A1604)

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李景权，男，助理研究员。主要研究方向：药学。E-mail：wzfsub12@126.com

1.内蒙古医科大学(010020)；2.巴彦淖尔市食品药品检验所(015000)