胆汁酸代谢改变对肝癌发生影响机制的研究

张 婷，董金珂，杨新瑞，杜桂芳，李因茵，卢姗姗，陆荫英，曲建慧，曾 珍

胆汁酸代谢改变对肝癌发生影响机制的研究

张 婷，董金珂，杨新瑞，杜桂芳，李因茵，卢姗姗，陆荫英，曲建慧，曾 珍

目的探讨胆汁酸（bile acids, BAs）各组分在乙型肝炎（乙肝）相关性肝细胞癌（hepatocellur carcinoma,HCC）患者血浆中的浓度及组成比例变化，进一步探索其与HCC的关系。方法用液相色谱-质谱联用手段分别检测24例HCC患者、15例乙肝肝硬化患者、6例慢性乙肝患者及12例健康对照者血浆中的各BAs组分的变化。用实时荧光定量PCR与免疫组织化学法检测15例肝癌组织与癌旁组织中IL-1β的表达水平。结果在24例HCC患者中，BAs组分胆酸、鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、石胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸相比乙肝肝硬化与健康对照组有明显升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05），其中石胆酸浓度在不同临床分期患者中差异有统计学意义，C期明显高于B期和A期。癌组织中IL-1β的表达水平低于癌旁组织。结论血浆胆汁酸中石胆酸的浓度增高与肝癌进展相关，有可能成为HCC进展的评价指标。

乙肝相关肝细胞癌；胆汁酸；IL-1β；靶向代谢组学

HBV在我国广为传播，感染了HBV的机体为了清除病原体而引起的长期慢性肝脏炎症，逐步发展成为肝纤维化，进而成为肝硬化。持续性的肝损伤及不断发生的肝细胞增殖和凋亡，诱导了约80%的肝细胞癌（hepatocellur carcinoma,HCC）的发生[1]，HCC是世界第6大恶性肿瘤而且预后效果极差[2]。肝功能的损害可造成机体胆汁酸（bile acids, BAs）代谢的紊乱。BAs是由胆固醇代谢产生的一类两性分子的总称，其作用功能涉及脂质的消化、吸收及激素的合成[3]。在肝脏病理状态下，BAs代谢障碍表现为患者血浆中BAs水平增高，组成比例失衡。

本文通过液相色谱-质谱联用手段分别检测HCC患者及对照者血浆中的各BAs组分的变化，并通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, RT PCR）与免疫组织化学法检测HCC患者肝癌组织与癌旁组织中IL-1β的表达水平，探讨BAs各组分的变化与HCC发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源及处理 血浆标本均为EDTA抗凝外周血血浆。其中慢性乙型肝炎患者（后简称HBV组）（6例）、乙型肝炎肝硬化（HBV related liver cirrhosis, HBV-LC）患者（15例）、HCC患者（24例，A期/B期/C期，10/7/7例）血浆标本取材均来自解放军第三〇二医院肝脏肿瘤诊疗与研究中心。 健康对照者（health control,HC）血浆标本均来自解放军第三〇二医院体检中心，共12例（表1）。肝组织标本共15例，均来自上述24名HCC患者的手术切除组织。

1.2 诊断与分期标准 HCC患者均为慢性乙型肝炎HCC患者，其诊断符合《原发性肝癌诊疗规范》（2017年）的标准[4]。HCC诊断：①具有肝硬化以及HBV感染诊断证据；②同期多排CT扫描和/或动态对比增强MRI检查显示肝脏占位在动脉期快速不均质血管强化，而静脉期或延迟期快速洗脱；③血清AFP≥400 μg/L持续1个月或≥200 μg/L持续2个月，并能排除其他原因引起的AFP升高，包括妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及继发性肝癌等。HCC的临床慢性乙型肝炎及HBV-LC的诊断依据《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）[5]。1.3 试剂和仪器 所用的试剂：EDTA抗凝采血管（BD），BAs各组分标准品（Sigma），甲醇、乙腈均为色谱纯，RT PCR所用引物（北京赛百盛公司合成），cDNA合成试剂盒（Thermal Fisher）， RT PCR试剂盒（ABI），兔抗人IL-1β一抗（Abcam），羊抗兔二抗（中山金桥）。所用的仪器为：Eksigent LC100和AB SCIEX Triple TOF 5600+（Waters）；色谱柱，Waters XBridge Peptide BEH C18 3.5 μm，2.1×100 mm（Waters）；预柱，Phenomenex C18，4×20 mm（Waters）。

表1 标本基本临床资料Table 1 Basic clinical data of the samples

1.4 血浆样品处理 -80 ℃低温保存的干燥后血浆样品，4 ℃解冻。定量量取约50 μl于1.5 ml EP管中，加入 0.5 μg/ml内标溶液 10 μl，冷蛋白沉淀液 300 μl，涡旋45 s，4 ℃，16 000 × g离心10 min，取上清液200 μl，吹干。用甲醇 50 μl复溶，进样 5 μl。

1.5 BAs检测方法 BAs标准品储备液配制，取适量BAs粉末溶于水-乙腈-异丙醇溶液 （水∶乙腈∶异丙醇=10∶6∶5），配制成浓度为10 mg/ml溶液。色谱条件为柱温40 ℃；流速为0.4 ml/min；流动相：A相，水+0.1%甲酸+10 mM乙酸胺；B相，80%甲醇+20%乙腈+0.1%甲酸。质谱条件，喷雾电压2.0 kV；毛细管温度，275 ℃；S-lens，55%；碰撞能量，27% HCD；分辨率设置，一级70 000@m/z 200，二级17 500@m/z 200；母离子扫描范围，m/z 300～1800；子离子扫描范围，m/z＞100。参照BAs标准品数据库，用PeakView 1.2软件将样品中的BAs定性，用MultiQuant2.1对定性的BAs定量，用样品中的内标校正后，用标准曲线计算相应浓度。

1.6 RT PCR法检测肝组织中IL-1β的表达水平 分离肝癌组织与癌旁组织，分别取约2 mg组织用液氮研磨，抽提总RNA，以总RNA为模板反转录合成cDNA。IL-1β引物为F 5’-TTACAGTGGCAATGAGGATGAC-3’；R 5’-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3’； 内 参 为β-Actin。RT PCR条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸1 min，循环40次。

1.7 免疫组织化学法检测肝组织中IL-1β的表达量 肝癌组织切片脱蜡处理后，经抗原修复，一抗、二抗按照1∶1000稀释后分别染色，苏木素核显色，细胞核呈深蓝色，IL-1β呈红色。

1.8 统计学处理 用SPSS 20.0软件分析。定量资料呈正态分布者以x±s表示，组间比较用成组t检验或F检验（组间方差齐）。患者血浆BAs各组分浓度均为非正态分布，多组比较采用Kruskal-Wallis检验，组间两两比较用Mann-Whitney检验，双侧检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BAs各组分浓度 采用液相色谱-质谱联用检测HC组、HBV组、HBV-LC组与HCC组血浆中BAs各组分浓度的变化，结果如图1所示，HCC组中胆酸（cholic acid, CA）、熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）、甘氨熊去氧 胆 酸（glycoursodeoxycholic acid, GUDCA）、鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholic acid, CDCA）、牛磺脱氧胆酸（tauro ursodesoxy cholic acid,TDCA）、 石 胆酸（lithocholic acid, LCA）、甘氨胆酸（glycocholic acid, GCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（glycochenodeoxycholic acid, GCDCA）、甘氨脱 氧 胆 酸（glycochenodeoxycholic acid, GDCA）的浓度相比HC组有明显升高，差异有统计学意义。其中，HCC组CA、CDCA、LCA、GCDCA、TDCA、GDCA的浓度与HBV-LC组也有明显升高，差异具有统计学意义。其他BAs如HDCA、DCA、GLCA、TCA、TUDCA等浓度的组间变化差异没有统计学意义，具体结果见图1。

2.2 不同HCC临床分期BAs组分浓度 HCC组中有明显变化的CA、CDCA、TDCA、LCA、GCDCA、GDCA浓度在HCC不同临床分期（A、B、C期）患者中比较结果见图2，仅LCA浓度在不同临床分期患者中差异有统计学意义，C期明显高于B期和A期，而B期与A期差异无统计学意义。BAs其余组分在各临床分期差异无统计学意义。

图1 HCC组（n=24）、HBV-LC组（n=15）、HBV组（n=6）、HC组（n=12）血浆中BAs各组分浓度变化*. P0.05；**. P＜0.050.01；***. P＜0.050.001；注：各图横标目为组别Figure 1 Bile acids concentration in plasma of HCC patients (n=24), HBV-LC patients (n=15), HBV patients (n=6) and health controls (n=12)

图2 不同分期HCC患者血浆中CA、CDCA、TDCA、LCA、GCDCA、GDCA的浓度*. P0.05；**. P0.01；***. P＜0.050.001；注：各图横标目为临床分期Figure 2 CA, CDCA, TDCA, LCA, GCDCA and GDCA concentration in plasma of HCC patients at different stages

2.3 BAs在癌旁组织及癌组织中IL-1β的表达的影响 本文通过RT PCR对15例HCC组患者肝癌组织与癌旁组织中IL-1β的表达水平进行检测。RT PCR结果显示，癌旁组织中IL-1β的表达水平为（1.02±1.27）×10-3，癌组织中的表达水平为（0.21±0.22）×10-3， 2者表达水平差异具有统计学意义（t=2.423，P=0.001），见图3A。免疫组织化学结果显示癌旁组织中IL-1β的表达量高于癌组织，见图3B。

图3 肝癌组织与癌旁组织中IL-1β的表达水平A. RT PCR；B. 免疫组织化学（20×）Figure 3 Expression of IL-1β in liver cancer tissue and paracancer tissue

3 讨 论

BAs是由胆固醇代谢产生的一类两性分子的总称，其功能涉及脂质的消化、吸收及激素的合成[6]。肝脏对BAs有高效清除作用，使BAs浓度维持在较低水平，故外周血血浆中BAs含量甚微。在人类肝脏中，胆固醇经代谢转化为初级BAs，包括CA及CDCA，随后进入肠道进一步转化为相应的次级BAs。CA、CDCA在结直肠内经过肠道细菌及其胆盐水解酶的解离，差向异构化，氧化及7α脱羟基活性等生物转化作用生成次级BAs如脱氢胆酸（deoxycholic acid, DCA）和LCA等[3,7-8]。约95%的次级BAs被肠道重吸收，经门静脉重新回到肝脏，与新合成的结合BAs一起再经过胆道排入肠道，称为BAs的肝-肠循环[9]。在生理状态下，上述过程受到一系列正、负反馈机制的精细调节，体内众多核受体如法尼酯受体、肝X受体、过氧化物酶体增值物激活受体、孕烷X受体以及跨膜G蛋白受体等参与BAs稳态的调节[10-11]。因此，血浆中BAs的测定能反映肝细胞合成、摄取及分泌功能。BAs异常不仅反映了肝脏的损害程度，也间接反映了肝内的胆/血屏障情况。有研究表明，肝硬化患者乃至HCC患者血清的总BAs浓度要明显高于健康人群[12-13]。本研究显示，HCC组中血浆 BAs中 CA、CDCA、TDCA、LCA、GCDCA及GDCA的浓度明显高于HBV-LC组与HC组，不同HCC临床分期BAs浓度比较显示，仅LCA浓度在不同分期差异有统计学差异。

研究发现CDCA及代谢产物DCA、LCA可对细胞内炎症小体NLRP3的活性产生双向调节，并影响肝癌形成[14]。而另有研究发现次级BAs LCA可以抑制骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中NLRP3炎症小体介导的Caspase-1活化，以及下游IL-1β的分泌[15]。同时有研究表明，肝脏中癌组织中NLRP3表达水平低于癌旁组织，同时IL-1β在癌组织的表达水平也低于癌旁组织[16]。本文RT PCR与免疫组织化学的结果也显示，血浆BAs浓度高的患者癌组织中IL-1β表达水平明显低于癌旁组织。由此推测，HCC中癌变的肝组织抑制肝脏对BAs的吸收，而过量的BAs如LCA通过抑制炎症小体进而抑制肝脏免疫功能，进一步促进肝脏癌变。结合血浆BAs中LCA的浓度与HCC进展呈正相关，可以推论血浆中BAs中LCA浓度的高低可能成为肝癌发生进展与免疫功能的评价指标。

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Influence of bile acid metabolism changes on pathogenesis of hepatocellular carcinoma

ZHANG Ting, DONG Jin-ke, YANG Xin-rui, DU Gui-fang, LI Yin-yin, LU Shan-shan, LU Yin-ying, QU Jian-hui, ZENG Zhen*Comprehensive Liver Cancer Center, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

ObjectiveTo investigate the changes of serum bile acids (BAs) concentration and components in patients with HBV related hepatocellur carcinoma (HCC), and explore the relationship between BAs and HCC.MethodsLiquid chromatography mass spectrometry was used to detect the concentration of serum BAs in 24 HCC patients, 15 HBV related liver cirrhosis patients, 6 chronic HBV hepatitis patients and 12 healthy controls. The expression levels of IL-1β in liver tissues and paracancer tissue were detected by real-time PCR and immunohistochemistry in 15 liver cirrhosis cases.ResultsThe cholic acid, chenodeoxycholic acid, tauro ursodesoxy cholic acid, lithocholic acid, glycochenodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid concentrations were significantly higher in 24 HCC patients than those in the heath control and liver cirrhosis group (P＜0.05). The concentrations of lithocholic acid (LCA) were positively correlated with the clinical stage of HCC and showed significant differences in different stages, the concentration at stage C was obviously higher than that at stage B and stage A. The expression level of IL-1β in cancer tissues was lower than that in adjacent tissues.ConclusionsThe increase of plasma bile acid LCA is correlated with the development of liver cancer. It may be an evaluation index for the progress of HCC.

hepatitis B virus related hepatocellular carcinoma; bile acid; IL-1β; targeted metabolomics

R735.7

A

1007-8134(2017)05-0293-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.012

国家自然科学基金面上项目（81372248，81672467）

100039 北京，解放军第三〇二医院肝脏肿瘤诊疗与研究中心（张婷、杨新瑞、杜桂芳、李因茵、卢姗姗、陆荫英、曲建慧、曾珍）；550004 贵阳，贵州医科大学（董金珂）

曾珍，E-mail： zengzhen1970@sina.com

*Corresponding author, E-mail: zengzhen1970@sina.com

（2017-03-24收稿 2017-07-18修回）

（本文编辑 闫晶晶）