高寒草地牧草内生细菌262AG6拮抗功能测定及鉴定

郭 海，杨成德，姚玉玲，崔月贞，牛小丽，薛 莉

(甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070)

高寒草地牧草内生细菌262AG6拮抗功能测定及鉴定

郭 海，杨成德，姚玉玲，崔月贞，牛小丽，薛 莉

(甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070)

为明确高寒草地牧草矮生嵩草(Kobresiahumilis)内生细菌262AG6的生防潜力，采用平皿对峙法测定其抑菌功能，并综合形态学特征和16S rDNA序列分析对其进行鉴定。结果表明，262AG6对马铃薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)的抑制效果达到81.33%，对其他多种病原真菌也具有良好抑制能力，且抑菌能力稳定；在含100 mg·L-1色氨酸和不含色氨酸的King培养液中分泌IAA的量分别为8.04 mg·L-1和7.98 mg·L-1；具有溶解无机磷和固氮的能力；262AG6革兰氏染色呈阳性，杆状，菌体大小为(1.63～ 3.65) μm×(0.38～0.95) μm，综合形态特性、16S rDNA和gyrB DNA序列分析将菌株262AG6鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

内生细菌；解淀粉芽胞杆菌；抑菌能力；鉴定

植物病害生物防治是利用生物或生物代谢产物控制植物病害的方法，由于其对环境友好和符合农业可持续发展观的特点受到广大植保工作者的青睐。目前，真菌、细菌、放线菌等微生物在生物防治方面都有较多研究，并取得明显进展。生防细菌因其种类繁多，总量庞大且易于培养和作用方式多样等特点成为近年来植物病害生物防治研究与应用的热点。植物内生细菌指能够在健康植株上定殖并与其创立共生联系的一个微生物群类。近年来的研究表明，植物内生细菌与宿主植物建立复杂的微生态系统，其通过固氮、溶磷、抑菌等生物功能促进植物生长和提高抗逆能力。当前，植物内生细菌已经成为农业上防控植物病害的重要手段，如高小宁等[1]报道，植物内生细菌Em7(Bacillussubtilis)对油菜菌核病的防治效果达50%～70%，与化学农药戊唑醇(Tebuconazole)和多菌灵(Carbendazim)相当；也有研究显示，从桔梗[2]、向日葵[3]、茄子[4]、山茶[5]、甜菜[6]、水稻[7]、针茅[8]、红树[9]和珠芽蓼[10]等植物体内分离获得的内生菌对其寄主病害的防控拥有优越的效果；植物内生细菌这一微生物群类在植物病害防治领域具有重要地位。

本研究以从东祁连山高寒草地矮生嵩草中分离的内生细菌262AG6为试验材料，对其固氮、溶磷等功能进行测定，并综合其形态特性和16S rDNA序列分析进行鉴定，以期丰富植物病害防治资源，为高寒草地牧草内生细菌资源的利用与开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用于病原真菌的培养和对峙试验；肉汁胨培养基(NA)用于内生细菌的活化、保存等；金氏(King)培养基用于产IAA试验；Pikovaskaia培养基和门金娜培养基分别用于有机磷和无机磷溶解试验；Ashby培养基用于菌株固氮能力测定[11]。

1.1.2 供试菌株 供试拮抗细菌：东祁连山高寒草地矮生嵩草内生细菌262AG6；供试病原真菌：马铃薯坏疽病菌(Phomafoveata)、马铃薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、马铃薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、马铃薯立枯丝核病菌(Rhizoctoniasolani)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、孜然根腐病菌(Fusariumsolani)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)。以上菌株均由甘肃农业大学植物保护学院提供。

1.2 方 法

1.2.1 抑菌能力测定 采用平皿对峙法[12-13]鉴定抑菌功能。将活化病原真菌制成直径0.6 cm的菌饼置于PDA平皿中央，在距菌饼25 mm处用十字交织法点接菌4次，对照组点接无菌水，每处理3次重复，25 ℃恒温培养(马铃薯坏疽病病菌处理置于20 ℃恒温培养)，待对照组铺满培养皿后，测量处理组菌落和对照菌落直径，并计算抑菌率(%)。抑菌率=[(对照组真菌直径-试验组真菌直径)/(对照组真菌直径-原菌饼直径)]×100%。

1.2.2 抑菌稳定性测定 将262AG6在NA平皿上持续接菌10次(每隔2 d转接1次)，然后以马铃薯炭疽病菌为指示菌并用平皿对峙法测定其抑菌能力。

1.2.3 对病原菌菌丝生长的干扰作用 挑取平皿对峙法处理中病原真菌菌丝和对照中正常菌丝于光学显微镜下观察比较菌丝形态特征，描述并照相。

1.2.4 其他生物学功能测定 固氮功能测定：将262AG6低龄菌悬浮液分开接种于Ashby无氮平皿和液体培养基，3次重复，以无菌水为对照，生长温度28 ℃，在第3、5、7 d 观察其变化，继代培养3代后平皿上有菌落并且培养液变混浊者即可认为具有固氮能力[14]。

溶磷能力测定[13-14]：(1)定性测定，将262AG6点接在 Pikovaskaia 培养基和门金娜培养基，每皿接5个点，28 ℃培养8 d后观测菌株在培养基平皿上形成的溶磷圈，并按照溶磷圈直径/菌落直径(D/d值)确定溶磷能力；D/d值与其溶磷能力成正比。(2)定量测定，将菌株262AG6接种于Pikovaskaia培养液，以不接菌处理为对照。28 ℃、160 r·min-1摇床培养10 d，4 ℃、10 000 r·min-1离心15 min后取上清液，采取钼锑抗比色法测定有效磷增加。

产IAA能力测定：采用Salkowski 比色法[15]测定262AG6的产IAA能力。

1.2.5 鉴定 形态观察：将活化后的262AG6接种于NA平皿培养基，观察菌落特征，拍照并描述，挑选低龄菌落进行革兰氏染色[11]和镜检，观察菌体形态和颜色，随机测量50个菌体的长和宽，并显微照相。

DNA提取：按照天根生化科技(北京)有限公司提供的试剂盒提取DNA并通过凝胶电泳查验，特异性DNA条带保存于-20 ℃冰箱，备用。DNA提取试剂盒为细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，版本号DP121221。

16S rDNA扩增：采用引物1(5′-GAAGT-CATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTGGA- AAGTTCGA-3′)和引物2(5′-AGCAGGG-TACGGATGTGCGAGCCATCTACGTCAGC-GTCAGTCAT-3′)进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性10 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后在72 ℃延伸 8 min，终止反应。50 μL反应体系：10×buffer(含MgCl2)5 μL，dNTP(5 mmol·L-1)1 μL，primer 1(10 μmol·L-1)1 μL，primer 2(10 μmol·L-1)1 μL，Taqpoly-merse(2 U·μL-1)0.4 μL，Target DNA(10 mg·L-1)1 μL，ddH2O 40.6 μL[12]。将扩增产物送至武汉金开瑞公司测序，将测序结果与GenBank已报道的序列进行同源性比对(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，并采用Clustal(1.8)软件进行多重序列比较，采用MEGA(5.0)的邻接法构建系统发育树，明确该菌株的系统发育学定位。

gyrB DNA扩增：采用引物UP-1S(5′-GAA- GTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTGG-AAAGTTCGA-3′) 和引物UP-2Sr(5′-AGCA- GGGTACGGATGTGCGAGCCATCTACGTC- AGCGTCAGTCAT-3′)进行扩增，扩增条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保持1 h[13]。25 μL反应体系：2×PowerTaqPCR Master Mix 12.5 μL，primer UP-1S(10 μmol·L-1)1 μL，primer UP-2Sr(10 μmol·L-1)1 μL，Target DNA(10 mg·L-1)1 μL，ddH2O 9.5 μL。

将16S rDNA扩增和gyrB DNA扩增产物送至武汉金开瑞公司测序，将测序结果与GenBank已报道的序列进行同源性比对(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，并采用Clustal(1.8)软件进行多重序列比较，采用MEGA(5.0)的邻接法构建系统发育树，明确该菌株的系统发育学定位。

2 结果与分析

2.1 262AG6生防潜力评估

由表1和图1可知，菌株262AG6对马铃薯炭疽病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯坏疽病菌、马铃薯立枯丝核病菌、番茄早疫病菌、小麦根腐病菌、孜然根腐病菌、黄瓜枯萎病菌的抑制率分别为81.33%、68.72%、67.50%、64.67%、56.79%、71.78%、66.24%和58.19%，说明，菌株262AG6对马铃薯等多种作物的多种病原真菌具有抑菌作用，抗菌谱广，可以一菌多防。

表1 262AG6对病原真菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of 262AG6 against phytopathogenic fungi

注：数据为“平均数±标准误”。下同。

Note:Data in the table indicate “Mean±Standard error”.The same below.

A.坏疽病菌处理 Treatment ofP.foveata；B.坏疽病菌对照 Non-treatment control ofP.foveata；C.炭疽病菌处理 Treatment ofC.coccodes；D.炭疽病菌对照 Non-treatment control ofC.coccodes；E.枯萎病菌处理 Treatment ofF.avenaceum；F.枯萎病菌对照 Non-treatment control ofF.avenaceum

图1262AG6对马铃薯3种病原真菌的抑制效果
Fig.1Inhibitoryeffectof262AG6on3speciesofpathogenicfungiinpotato

将262AG6继代培养10代后与马铃薯炭疽病菌十字交织培养，发现拮抗菌262AG6的抑菌效果在其继代培养之后差异不显著(P<0.05)，说明该拮抗菌株抑菌能力稳定(表2)。将马铃薯坏疽病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯坏疽病菌与262AG6进行对峙培养，发现病原菌菌落生长受到显著影响，显微观察发现菌丝正常生长也受到较为明显的影响，表现为畸形，原生质外泄，菌丝产生泡囊、变形、扭曲(图2)。

表2 继代培养的262AG6对马铃薯炭疽病菌(C.coccodes)抑制效果Table 2 Inhibitory rate of subculture 262AG6 against C.coccodes

注：数值后小写字母相同表示在 0.05 水平差异不显著。

Note:Data followed by the same lowercase letters indicate no significant difference at 0.05 level.

A.坏疽病菌处理 Inhibit hyphoae ofP.foveata； B.坏疽病菌对照 Normal hyphoae ofP.foveata；C.炭疽病菌处理 Inhibit hyphoae ofC.coccodes； D.炭疽病菌对照 Normal hyphoae ofC.coccodes；E.枯萎病菌处理 Inhibit hyphoae ofF.avenaceum；F.枯萎病菌对照 Normal hyphoae ofF.avenaceum

图2262AG6对病原真菌菌丝生长的干扰作用
Fig.2Effectof262AG6ongrowthofpathogenicfungusmycelium

2.2 262AG6生物学功能测定

溶磷能力测定结果显示， 262AG6在Pikovaskaia平皿上培养8 d后产生明显的溶磷圈，D/d的值为1.19，门金娜培养基上未形成溶磷圈；定量测定发现，菌株262AG6在Pikovaskaia培养液中有效磷增加量为1.01 mg·L-1，说明，该内生菌株对无机磷具有消溶能力，不能消溶有机磷。

定性测定产IAA能力，发现接入262AG6的处理组和对照组的King培养液的颜色都变为红色，说明262AG6能够产IAA。PC曲线：y=0.042x-0.051(R2=0.914)；S2曲线 ：y=0.009x+0.719 (R2=0.989)；x代表IAA浓度，y代表OD530。定量研究表明，遵照PC曲线和S2曲线基准方程，菌株在2种培养液中培育12 d后，在King培养液不含色氨酸的情况下262AG6产生IAA的量为7.98 mg·L-1,在King培养液含100 mg·L-1色氨酸的情况下产生IAA的量为8.04 mg·L-1，色氨酸对262AG6生产IAA的量影响不显著，说明，262AG6不依赖外源色氨酸即可合成IAA。

固氮能力测定结果显示，262AG6可以在Ashby培养基上生长，连续培养3代后，262AG6也能在无氮培养基上生长并能使培养液变混浊，证明262AG6具有固氮能力。

2.3 262AG6的鉴定

2.3.1 形态特性 262AG6革兰氏染色为阳性(图3)，菌体杆状，菌体为(1.63～3.65) μm×(0.38～0.95) μm。在28 ℃NA培养基上培育3 d 后，菌落类似圆形，直径为6～8 mm，边沿不规整，中间凸起，表形轮廓不平整，不透明，呈微乳黄色(图4)。

图3 262AG6革兰氏染色Fig.3 262AG6 gram staining

图4 262AG6在NA培养基上的菌落特征Fig.4 Colony morphology of 262AG6 on NA medium

2.3.2 DNA序列分析 提取262AG6的DNA，经16S rDNA 和gyrB PCR扩增后产物经凝胶电泳检测，分别在1 500 bp和1 000 bp处有清晰PCR特异性条带，将产物测序所得该菌株的16S rDNA序列碱基长为1 460 bp，gyrB序列碱基长为1 075 bp。

经Blast相似性分析表明，菌株262AG6(Genbank登陆号：KF836523)与Genbank数据库下载的Bacillusmethylotrophicus(KC79 0303)、Bacillusamyloliquefacienssub sp.Plantarum(JN700159)、Bacillustequilensis(HQ857764)、Bacillussubtilis(JQ900635)、Bacillustequilensisisolate NIO-Zn4(KJ847721.1)的相似度都在99%以上，运用 MEGA 5.0的邻接法构建系统发育树(图5，图6)，发现其与Bacillusmethylotrophicus(KC790303)、Bacillusamyloliquefacienssub sp.Plantarum(JN700159)、Bacillustequilensis(HQ857764)、Bacillussubtilis(JQ900635) 等菌株的遗传距离均小于0.000 5，确认262AG6(KF836523)为芽胞杆菌属，但无法确认其属内种的地位。

经Blast相似性分析表明，262AG6与已报道的Bacillusamyloliquefaciens(JX014631.1)、Bacillusmethylotrophicus(CP003838.1)、Bacillusvelezensis(CP017747.1)、Bacillussubtilis(CP009749.1)种的同源相似性都在99%以上，结合形态特性和16S rDNA分析最终将其鉴定为解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens) 。

图5 262AG6的16S rDNA系统发育树Fig.5 16S rDNA phylogenetic tree of 262AG6

图6 262AG6的gyrB系统发育树Fig.6 gyrB phylogenetic tree of 262AG6

3 讨 论

植物内生细菌是大自然对植保工作者的馈赠，拥有极高的利用价值，相关的报道较多，如陈越渠等[16]从杨树枝条上获得的枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)对杨树烂皮病的防控成果达85.4%和69.6%；赵龙飞等[17]从大豆根瘤菌中分离出的17株内生菌对稻瘟病菌具备抑菌功效；王涵琦等[18]发现ZHA10对马铃薯炭疽菌的平皿对峙控制率达72.62%；本研究显示，262AG6对马铃薯炭疽菌的抑菌率达81.33%，并且该菌株抑菌谱较宽，对马铃薯、小麦、番茄等寄主植物的8病原菌的抑制率均高于50%，10代以内其继代稳定性良好，具有开发为生物农药的潜质。

内生菌的产IAA、固氮和溶磷功能可能对植物有促生作用，畅涛等[19]研究发现，珠芽蓼内生菌ZA1具有固氮和分泌生长素IAA功能，对马铃薯具有促生和增产的效果；262AG6在King培养液不含色氨酸的情况下产生IAA的量为7.98 mg·L-1，在含100 mg·L-1色氨酸的King培养基中分泌IAA的量为8.04 mg·L-1，且具有固氮和和溶解无机磷的能力，生物功能多样化，有巨大的开发为微生物肥料的潜力，但其抑菌防控机制以及田间的实际防病促生成效还有待更深入的测验。林玲等[20]研究认为，植物内生细菌对植物有防病促生的功能，这与本研究结果一致，说明，262AG6具备开拓成为防治马铃薯真菌病害的生物农药和微生物菌肥的潜能。

4 结 论

高海拔地区牧草矮生嵩草的内生细菌262AG6对马铃薯多种病原真菌有明显的抑制效果，而且该菌株的抑菌谱较广，可以产IAA，溶解无机磷，有固氮能力，为G+，菌体大小为1.63～3.65 μm×0.38～0.95 μm。综合形态特性、16S rDNA分析和gyrB DNA序列分析，将其鉴定为解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)。

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IdentificationandDeterminationofAntagonisticFunctionofEndophyticBacteria262AG6fromKobresiahumilisinAlpineGrassland

GUO Hai, YANG Chengde, YAO Yuling, CUI Yuezhen,NIU Xiaoli and XUE Li

(College of Plant Protection, Gansu Agricultural University, Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province,Lanzhou 730070, China)

In order to evaluate the biological control potential of endophytic bacteria 262AG6 isolated fromKobresiahumilisat alpine grassland, the inhibitory effects were studied by dual culture againstColletotrichumcoccodes, and the 262AG6 was identified by morphological characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The results showed that the inhibition ratio of 262AG6 strain againstColletotrichumcoccodeswas as high as 81.33%, and also presented a higher stability and inhibitory effects on other species of pathogens.The secreted contents of IAA were 8.04 mg·L-1with 100 mg· L-1tryptophan on the King media and 7.98 mg·L-1without ryptophan, and the strain also had ability to dissolve inorganic phosphorus and to fix nitrogen.The thalli was rod-shaped, gram-positive and (1.63-3.65) μm×(0.38-0.95) μm in size.The 262AG6 was identified asBacillusamyloliquefaciensbased on 16S rDNA and gyrB DNA sequence analysis and the morphological characteristics.

Endophytic bacteria;Bacillusamyloliquefaciens; Inhibitory effects; Identification

2016-12-18

2017-03-15

The National Natural Science Foundation of China (No.31660148).

GUO Hai, male, master student.Research area:plant pathology.E-mail:guoh456@163.com

S43

A

1004-1389(2017)10-1529-08

日期：2017-10-18

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.032.html

2016-12-18

2017-03-15

国家自然科学基金(31660148)。

郭 海，男，在读硕士，研究方向为植物病理学。E-mail:guoh456@163.com

杨成德，男，教授，硕士生导师，研究方向为植物病理学。E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

CorrespondingauthorYANG Chengde,male,professor,master supervisor.Research area:plant pathology. E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

(责任编辑：郭柏寿Responsibleeditor:GUOBaishou)