江陵天星观一号楚墓出土饱水木漆器F446中真菌对硬松木的腐蚀研究

章俊

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

雷琼，邱祖明

(湖北省荆州文物保护中心，湖北 荆州 434020)

范晓丹，汪俭，马立安

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

江陵天星观一号楚墓出土饱水木漆器F446中真菌对硬松木的腐蚀研究

章俊

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

雷琼，邱祖明

(湖北省荆州文物保护中心，湖北 荆州 434020)

范晓丹，汪俭，马立安

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

采用ITS序列分析方法对饱水木漆器F446(编号F)及其保存水环境(编号S)中的真菌进行了鉴定，并选取典型菌按5×107个真菌孢子/瓶菌量接种马尾松(Pinusmassoniana)心材(悬于无菌自来水中)，28℃培养300d，测试木材的损失率。结果发现，从F中分离的真菌犁头霉属(Absidia)为优势菌属，其余真菌菌属有曲霉属(Aspergillus)和青霉菌属(Penicillium)，S中真菌曲霉属(Aspergillus)为优势菌属，其余真菌菌属为枝孢霉属(Cladosporium)、青霉菌属(Penicillium)及踝节霉菌属(Talaromyces)。挑选从F和S中分离出的14株典型菌进行木块腐蚀试验，与对照组比较，其中有4株菌对马尾松心材的腐蚀率差异达到极显著(P<0.01)，2株菌对马尾松心材的腐蚀率差异达到显著(P<0.05)；这些真菌对马尾松木材有一定的腐蚀作用，但是腐蚀率非常低，最高仅2.77%，表明这些真菌对试验木材马尾松腐蚀并不严重。

饱水木漆器；ITS序列分析；木材腐蚀率；文物保护

我国木漆器历史悠久，工艺精湛，不同时代有不同的风格，具有很高的考古价值及观赏价值。然而，木漆器出土以后，易干裂变形，主要还是保存在水池中[1,2]。文物木漆器在地下密封环境下，微生物代谢活动几乎停滞，对木漆器的腐蚀相对有限[3]，但是，文物出土以后，一旦环境适宜，微生物就会大量繁殖，山西翼城和长沙谭家坡考古遗址都曾爆发过大规模真菌污染现象[4,5]。微生物对木质文物有腐蚀作用，尤其是在环境条件适宜的情况下，有些真菌对木材有着很大的腐蚀率，甚至高达60%以上[6,7]。1978年，饱水木漆器F446出土于天星观一号楚墓，保存在荆州博物馆水池中近40a。本研究对文物木漆器F446样品及其保存水环境样品中分离的真菌进行了鉴定，并模拟文物保存的水环境，评价了其对木材腐蚀性影响，并针对腐蚀性强的真菌，拟筛选杀菌抑菌剂，以期为延长饱水木漆器的保存期提供生物学保护依据。

1 材料与方法

1.1材料

菌株：试验菌株为木漆器F446(编号F)及保存水环境(编号S)中分离的真菌，保存于长江大学生命科学学院微生物实验室[8]。根据菌落特征、菌丝和孢子结构与形态，将F中分离的真菌初步分为5类，每类选取1株菌，编号分别为F-1～F-5；S中分离的真菌初步分为9类，每类选取1株菌，编号分别为S-1～S-9。

马尾松：2根，购自湖北省荆州市某木材市场。

试剂：ITS序列扩增通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)[9]由上海生工生物(Sangon)公司合成，PCR所用试剂购于北京鼎国生物公司。其他常用试剂，如CTAB、Tris-HCl、NaCl、EDTA、Tris饱和酚、氯仿和异戊醇等试剂为分析纯或化学纯。

1.2方法

1.2.1培养基配制

PDA培养基主要成分：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。按文献[10]所述方法进行配制。

1.2.2基因组DNA提取

将PDA培养基上28℃培养2d的真菌菌丝体以无菌刮铲刮至预冷的研钵(-80℃过夜)中，快速研磨为粉末，装入1.5mL EP管，并加入800μL 65℃预热的CTAB缓冲液(2% CTAB，100mmol/L pH为8.0的Tris-HCl，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA)，65℃水浴30min；加入等体积的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，12000r/min离心5min，取上清液，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12000r/min离心5min，取上清液，加-20℃预冷的无水乙醇，混匀并放置-20℃冰箱中30min；12000r/min离心10min，然后倾倒液体，并用预冷的70%乙醇洗涤沉淀(基因组DNA)2次，晾干后加入50μL ddH2O，4℃或-20℃冰箱中贮存备用。

1.2.3ITS序列分析

PCR反应体积为50μL，其体系为5μL 10×Taq Buffer，5μL dNTPs(2mmol/L)，1μL Taq (2U/μL)，1μL上、下游引物(各10mmol/L)，33μL ddH2O，4μL基因组DNA模板。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。真菌ITS4和ITS5扩增的片段长度为500～700bp，合格的PCR产物送上海生工生物公司测序。序列在NCBI上进行比对，单个靶区域序列比对真菌种属鉴定标准参照文献[11]，并采用MEGA6.0软件进行真菌菌群组成分析。

1.2.4测试菌对木材的腐蚀作用

按文献[12]的方法选取马尾松心材(边部内侧与髓心之间颜色较深部分)，切割成2cm×2cm×1cm小块状，装入烧杯放入烘箱中(103±2)℃烘至恒重[13]，每次称量前将木块放入干燥器中冷却。恒重后称量10g左右的木块分装在规格相同的蓝盖螺纹广口圆瓶中，121℃ 30min灭菌后冷却备用[12,14]。将菌体接种至PDA培养基上培养5～7d，无菌水冲洗菌体后过滤收集菌孢子，并采用血球计数板显微镜下计数，每瓶接种孢子数目为5×107个，用无菌自来水定容至250mL，每菌株6个重复，并设不接菌对照组(CK)，28℃培养300d后，除去木块表面真菌，烘干至恒重后测定木块重量，计算木块损失率[13]，并采用SPSS19.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1真菌的鉴定

真菌ITS4和ITS5扩增片段比对结果如表1所示，结合图1(真菌菌群组成图)，将14株真菌鉴定为5个属。其中，F中，犁头霉属(Absidia)为优势菌属，占木材样品真菌总数的69.2%；S中，曲霉属(Aspergillus)为优势菌属，占水样真菌总数的61.1%。F-1和S-1为黄曲霉(Aspergillusflavus)，F-2和S-8为杂色曲霉(Aspergillusversicolor)，F-3为犁头霉属(Absidiasp.)，F-4和S-9为青霉菌属(Penicilliumsp.)，F-5为烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)，S-2为枝孢霉属(Cladosporiumsp.)，S-3为土曲霉(Aspergillusterreus)，S-4为菌核曲霉(Aspergillussclerotiorum)，S-5为Penicilliumgeorgiense，S-6和S-7为踝节霉菌属(Talaromycessp.)的不同种。

表1 F446文物木漆器样品及其水环境中真菌序列比对结果

图1 F446文物木漆器样品及其水环境中真菌菌群组成

2.2真菌对马尾松心材的腐蚀

14株真菌对木材腐蚀试验结果见表2。与对照组CK相比较，F-1(Aspergillusflavus)、F-5(Aspergillusfumigatus)、S-1(Aspergillusflavus)、S-2(Cladosporiumsp.)对马尾松心材的腐蚀率较高，分别为2.77%、2.58%、2.57%和2.66%，达到极显著性差异(P<0.01)；F-2(Aspergillusversicolor)和S-7(Talaromycessp.)对马尾松心材的腐蚀率分别为2.56%和2.55%，达到显著性差异(P<0.05)，其余真菌对马尾松心材无明显的腐蚀作用(P>0.05)。

表2 真菌对马尾松心材的平均损失率

注：**表示极显著(P<0.01)，*表示显著(P<0.05)，未标注表示不显著(P>0.05)。

3 讨论与结论

本研究从F和S中分离的真菌共计5个属，分别为曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、踝节霉菌属(Talaromyces)、青霉菌属(Penicillium)和枝孢霉属(Cladosporium)。F中，犁头霉属(Absidia)为优势菌属，分离的菌株ITS序列相似度仅96%，可能为一个新种，且在其保存的水环境中未分离得到，说明分离得到的犁头霉属可能来源于木漆器样品而非保存环境。S中，曲霉属(Aspergillus)为优势菌属，还分离得到青霉菌属(Penicillium)、踝节菌属(Talaromyces)和枝孢霉属(Cladosporium)。青霉、曲霉是空气中常见的微生物，在纸质、纺织及竹木文物病害微生物调查中都曾发现[15～17]，由此可见，水样中真菌可能主要来源于保存环境。

F和S中分离的真菌皆为霉菌。霉菌喜好潮湿环境，这也是荆州博物馆暗室水槽中保存的文物木漆器F446(编号F)及保存水环境(S)真菌为霉菌的原因。但是，荆州博物馆保存木漆器的水池深达1m左右，室温常年保持较低水平，池水定期更换，可以有效控制文物木漆器保存环境中的霉菌的繁殖。所以，F和S中分离的真菌数目较少，分别为90CFU/g和5CFU/L[8]。通过对分离的真菌进行腐蚀作用测定，发现曲霉属(Aspergillus)、枝孢霉属(Cladosporium)和踝节霉菌属(Talaromyces)部分菌株对马尾松心材存在腐蚀作用。霉菌主要生长在木质文物表面或近表面，但其菌丝也可沿木材纹孔侵入木质文物内部，通过分泌胞外酶分解一些复杂的有机物，如纤维素、几丁质、蛋白质等，造成文物的破坏。田金英等[18]研究发现大量的霉菌对文物造成巨大的破坏，霉菌包括青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、枝孢属(Cladosporium)、木霉属(Trichoderma)等多类霉菌，涉及的文物有书画、丝织品、竹木、漆器、壁画等。

本研究中真菌对马尾松心材的损失率最大仅2.77%，属于微损，且文物木漆器保存环境及其自身真菌数目均处于一个较低水平，说明真菌对文物木漆器F446的腐蚀作用有限。但是，由于木漆器样品及其水环境中存在的真菌主要类别为霉菌，霉菌易产生分生孢子，繁殖力极强，一旦条件适宜，短时间会快速爆发，存在着潜在风险，所以博物馆对木器漆保存环境的控制不可松懈。

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2017-04-14

出土木漆器保护国家文物局重点科研基地开放课题(33110016)。

章俊(1991-)，男，硕士生，研究方向为环境微生物研究。通信作者：马立安,malian@yangtzeu.edu.cn。

[引著格式]章俊,雷琼，邱祖明,等.江陵天星观一号楚墓出土饱水木漆器F446中真菌对硬松木的腐蚀研究J.长江大学学报(自科版) ，2017，14(18)：47～50，60.

Q939.98

A

1673-1409(2017)18-0047-04

[编辑] 余文斌