小鼠胎儿与幼鼠脑蛋白的SDS-PAGE分析

俞海东，韩荣勋，罗静波，许巧情，杨军

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

小鼠胎儿与幼鼠脑蛋白的SDS-PAGE分析

俞海东，韩荣勋，罗静波，许巧情，杨军

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

采用SDS-PAGE凝胶电泳法，通过比较分析妊娠16.5d的鼠胎儿脑蛋白样品及出生后7d幼鼠脑蛋白样品的蛋白组成，研究了鼠大脑发育过程中出生前后脑蛋白质组成的差异。分离后的凝胶经考马斯亮蓝染色得到的电泳图谱分析结果表明，采用8%的分离胶时观察到4条电泳条带存在差异，而采用15%的分离胶时则有2条电泳条带存在差异。由此表明，在2个不同发育时期的样品中共发现有6条蛋白质条带存在表达差异。

SDS-PAGE；妊娠16.5d；出生7d；脑蛋白；小鼠

蛋白质在基因实现其功能的过程中发挥着重要的作用。脑中蛋白质占脑总重量的1/3左右，同时脑蛋白的研究也是蛋白质研究中的一个重要领域。大脑的发育并不是出生后才开始的，在胎儿阶段，大脑就在进行着自己的发育过程。对出生后10、17、24d等不同脑发育期C57/BL6小鼠的研究表明，小鼠脑组织发育期间的细胞增生和分化与发育时期和脑组织区域相关[1]。目前国内外对于蛋白质的研究主要是集中于蛋白质组学的研究和特定蛋白质的功能研究。因此，本研究采用SDS-PAGE分析方法对怀孕16.5d鼠胎儿和出生7d的幼鼠脑蛋白质组成进行了比较分析，从蛋白质分子水平探索出生前后小鼠脑蛋白整体变化规律，以为研究小鼠大脑发育相关蛋白质和找出大脑发育的关键蛋白质提供参考。

1 材料与方法

1.1样品的采集和准备

用健康的4周龄以上小白鼠母鼠和公鼠，母鼠在下午腹腔注射5IU的PMSG 48h后再注射5IU的HCG。注射完HCG的小鼠以1∶1的公母比例合笼过夜。第二天早晨观察母鼠是否有阴道栓存在，有阴道栓的母鼠即可认为已怀孕并开始计算怀孕日期。之后在妊娠第16.5天和小鼠出生后第7天收集胎儿和幼鼠大脑作为实验样品。

收集的脑组织用PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS称重，将0.1g脑组织放入玻璃匀浆器，加入1000μL裂解液(0.3%SDS、3%DTT、蛋白酶抑制剂、和0.5mol/LTris/HCl，pH8.0)充分混合后在低温条件下对样品进行超声波粉碎处理，再在室温条件下反应1h后在4℃、12000r/min条件下离心20min去除沉淀物。离心后取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作为标准溶液，采用双缩脲法测定蛋白浓度后分装成每管60μg样品并保存于-70℃冰箱中。

1.2SDS-PAGE分析

SDS-PAGE采用8%和15%分离胶[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40%(29∶1)Acry/Bis、蒸馏水、10% SDS、10% APS、TEMED]，本研究采用同等蛋白质含量与同等样品体积的上样方法，上样顺序为Marker、60μg出生7d后的幼鼠脑蛋白、60μg怀孕16.5d的小鼠胎儿脑蛋白。在100V电压条件下进行分离，实验所用Marker电泳后出现7条条带，分子质量分别为200、150、100、80、60、40ku。

电泳结束后取出凝胶，经超纯水漂洗后将凝胶放入固定液[30%(v/v)甲醇、10%(v/v)醋酸]中固定1h，然后取出凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中染色24h。染色结束后用脱色液(1%醋酸)脱色后进行图像采集。

2 结果与分析

对相同蛋白质质量的怀孕16.5d的小鼠胎儿脑蛋白和出生7d的幼鼠脑蛋白，用8%、15%的分离胶在相同电泳条件下进行SDS-PAGE凝胶电泳，所得的电泳图谱见图1和图2。由图1可以看出，在8%的分离胶中，分子质量60ku以下的条带，怀孕16.5d的样品比出生7d的样品少1条；分子质量40ku以上的条带，怀孕16.5d的样品比出生7d的样品少1条；分子质量40ku以下的条带，怀孕16.5d的样品比出生7d的样品少1条；分子质量30ku以下的条带，怀孕16.5d的样品比出生7d的样品多1条。而在15%的分离胶中可观察到，分子质量40ku以上的条带，怀孕16.5d的样品比出生7d的样品多1条；分子质量30ku以下的条带，在出生7d的样品中没有条带，在怀孕16.5d的样品中只有1条(图2)。

3 讨论与结论

在胎儿发育中，脑的发育是重要组成部分。胎儿期、围产期、新生儿期，各种内外环境的改变和各种因素都可能对发育中的脑造成影响[2]。小鼠大脑的发育过程大体上可以划分为神经管形成阶段、神经上皮-脑泡形成阶段、神经元迁移分化阶段及神经元成熟阶段4个阶段[3]。而小鼠脑蛋白的生成是从神经管形成阶段就开始的，因此对于小鼠脑蛋白的研究也必须从胎儿时期开始，这是系统性地研究小鼠脑部发育所必须的。在蛋白组学研究方面，已经开展的脑蛋白质组图谱的绘制研究对象主要有人脑、鼠脑、人脑脊液、垂体等[4]。Tsugita等[5]对近交系C57BL/6小鼠大脑的1000余种蛋白进行了功能上的分类，而在特定蛋白质的功能研究领域方面，李波等[6]发现在小鼠脑发育过程中葡萄糖调节蛋白GRP78和GRP94与神经细胞的分化和脑的形态建成有关，它们分别在脑发育的不同时期可能起着特异性地参与神经细胞分化基因产物的折叠和翻译调控作用。

而小鼠胎儿的脑形态在怀孕12.5d时初步建立，在后期的胚胎发育过程中，脑的组织形态进一步完善，脑器官形态逐步成熟[7,8]。

为了探讨出生前后小鼠脑蛋白整体变化规律及与大脑发育相关的蛋白质，本研究采用SDS-PAGE方法比较分析了怀孕16.5d和出生7d的小鼠脑的主要蛋白质组成。结果表明在凝胶图谱中两者蛋白质表达表现出了显著差异。在8%的分离胶上进行的SDS-PAGE凝胶电泳图谱上观察到出生7d小鼠脑蛋白样品与怀孕16.5d胎儿脑蛋白样品有4条电泳条带存在差异。在15%的分离胶上进行的SDS-PAGE凝胶电泳图谱上观察到出生7d小鼠脑蛋白样品与怀孕16.5d胎儿脑蛋白样品有2条电泳条带存在差异。15%的分离胶由于较小的孔径能把分子量较小含量丰富的酪蛋白分离开来，所以能看到高分子量蛋白质组分分离后的条带。

在此前与老化和发育相关的研究中，王静等[9]采用双向电泳方法分析了胚胎16d、出生后7d及出生后60d等3个发育时期的C57/Bl6雌性小鼠脑组织，并鉴定出8个蛋白点，其中α烯醇酶、磷蛋白质P19及2个肌动蛋白在各发育阶段均有稳定表达，而C14orf166同源蛋白、28×103热/酸稳定的磷蛋白、3-巯基丙酮酸硫基转移酶、40S核糖体蛋白S3a等4个蛋白随年龄增大而丰度减低。之后，朱蕾[10]在采用双向电泳方法分析的快速老化模型小鼠年龄增加过程中脑蛋白质组研究中发现，在海马组织蛋白中有多个差异表达的蛋白点存在。而在与疾病相关的脑蛋白研究中，谢妮等[11]在采用人类巨细胞病毒(HCMV)感染小鼠脑组织前后的比较蛋白质组学双向电泳技术研究中发现显著差异点36个，并鉴定出HCMV被膜蛋白pp65等6个蛋白。吕琳等[12]采用iTRAQ技术对弓形虫慢性感染小鼠与健康小鼠的脑组织进行蛋白组学分析时发现了461个差异表达蛋白。

由于本研究采用的是比较简便的SDS-PAGE法，所以只能观察到不同时期蛋白条带之间的差异，要了解表达有差异的蛋白质条带的具体信息，需要进行进一步的分析鉴定。本研究揭示了小鼠在胎儿及幼鼠阶段的脑蛋白质组成的差异，这对进一步研究小鼠大脑发育相关蛋白质并找出大脑发育的关键蛋白质提供了基础资料。

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[12] 吕琳, 王亚培, 黄万意,等.弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组学[J].中国兽医学报, 2017, 37(5)：875～882.

2017-07-07

长江大学博士启动基金项目(120/801200010128)。

俞海东(1978-)，女，讲师，博士，主要从事蛋白质的色谱分离与质谱分析研究。通信作者：韩荣勋，hanrongxun@126.com。

[引著格式]俞海东，韩荣勋，罗静波，等.小鼠胎儿与幼鼠脑蛋白的SDS-PAGE分析[J].长江大学学报(自科版)，2017,14(18)：44～46.

S593+.2；Q959.837

A

1673-1409(2017)18-0044-03

[编辑] 余文斌