银粉背蕨配子体及幼孢子体发育的研究

陈思琦 简金晶 张 妍 戴锡玲

(上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234)

银粉背蕨配子体及幼孢子体发育的研究

陈思琦 简金晶 张 妍 戴锡玲*

(上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234)

银粉背蕨是一种小型观赏蕨类植物，但目前我国对该蕨的研究还不够成熟。本文利用改良Knop’s培养基和腐殖土培养银粉背蕨的孢子，观察其配子体及幼孢子体形态发育特征，并研究了其配子体发育的最适培养基pH值。研究结果显示：(1)银粉背蕨孢子黄褐色，具三裂缝，极面观三角圆形，赤道面观为近半圆形，孢子具网状纹饰；孢子萌发为书带蕨型；原叶体发育为水蕨型；颈卵器和精子器为薄囊蕨型；成熟原叶体为对称的心脏形，不具毛状体；上述特征为银粉背蕨孢子和配子体发育的稳定特征。(2)培养基pH值在7.0～9.0时随着碱性的增强，银粉背蕨孢子萌发和配子体生长发育速度逐渐增加。(3)利用腐殖土培养银粉背蕨孢子，7～8周可发育成幼叶，成苗率达90%，成苗健壮，根系发达，是扩繁银粉背蕨的适宜方式。本文为资源植物银粉背蕨人工繁殖和演化研究提供科学依据。

银粉背蕨；配子体发育；幼孢子体；pH值

银粉背蕨(Aleuritopterisargentea(Gmel.) Fee)为中国蕨科(Sinopteridaceae)粉背蕨属(Aleuritopteris)植物[1]；因其株型小巧且环境适应性强，叶形奇特，叶背为独特的银白色，是难得的一种小型观赏蕨类[2]。同时，银粉背蕨还具有活血调经，补虚止咳的药用价值[3]。

王琳等[4]首先以银粉背蕨叶柄为材料诱导愈伤组织，建立无性系，研究显示试管苗移栽到炉灰渣后生长最佳。此后，黄迪等[5]对银粉背蕨配子体发育各阶段的形态特征进行初步观察的同时，研究孢子贮藏时间、培养基质、无机盐浓度和蔗糖浓度等培养条件对银粉背蕨孢子萌发、配子体发育及孢子体成苗的影响，结果表明常规培养基质中泥炭土和河沙的混合基质是银粉背蕨孢子萌发和生长的最佳基质；无菌培养条件下MS培养基是最适培养基，4%的蔗糖添加对原叶体增殖和发育最佳。银粉背蕨具有如此突出的观赏和药用价值，但目前我国对银粉背蕨的研究还并不是十分完善。例如，在各种影响孢子萌发和配子体发育的环境条件中基质pH值常常被忽视。大多数蕨类植物的孢子培养基(液)pH值在5.0～7.0[6]，但不同种类植物孢子萌发所需要的培养基(液)的最适pH值范围存在差异[7]，因此，在孢子培养时需要确定培养基的最适pH值范围。

在保护野生蕨类资源和丰富我国资源蕨类植物的背景下，本文利用改良Knop’s培养基和腐殖土培养银粉背蕨的孢子，详细观察其孢子萌发、配子体以及幼孢子体各发育阶段的形态特征，并研究银粉背蕨配子体发育的最适培养基pH值，为资源植物银粉背蕨演化研究和人工繁殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

银粉背蕨的孢子于2014年7月采自浙江大明山岩石缝中，凭证标本保存在上海师范大学蕨类植物标本室。

1.2 方法

改良Knop’s培养基无菌培养。将3%次氯酸钠溶液倒入放有孢子的离心管中充分震荡摇匀后离心，无菌水漂洗3遍，在超净台上接种于改良Knop’s[8]培养基上。置于ZRX-300E型智能人工气候培养箱中培养，光照12 h，光照强度2 000 lux，温度为25±1℃，湿度为60%～70%。重复培养3次，每次5份。精子用鲁哥氏染液固定染色[9]。在配子体发育各个阶段用Nikon E800型光学显微镜进行活体观察并拍照。

在配制好的改良Knop’s培养基中加入1 mol·L-1的NaOH和HCl溶液，用PHSJ-4F型酸度计测培养基pH值，配制成pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的6个组，并分别标记为1～6组。每组接种5个培养皿(盖直径60 mm)。

对商用腐殖土进行高温灭菌处理后，冷却到室温。将孢子用3%次氯酸钠溶液消毒，清洗后将孢子放入喷壶中加蒸馏水，充分摇晃，均匀地喷洒在腐殖土表面。用带孔的保鲜膜将培养皿进行封口，以保持土壤中的水分。待土壤中的银粉背蕨原叶体长出幼孢子体时，在解剖镜下，用解剖针轻轻挑起原叶体，快速栽入准备好的花盆中。花盆中从下到上为鹅卵石、砂土和商用腐殖土以1∶1∶3的层次比例放置。并在花盆底放置有水的托盘，保持土壤湿度。用带孔的保鲜膜将花盆进行封口。将移栽好的植株放在朝阳处室温培养，定期浇水，保持土壤湿润。

2 观察结果

2.1 银粉背蕨配子体和幼孢子体的发育

2.1.1 孢子及孢子萌发

孢子黄褐色，具三裂缝，呈辐射对称；极面观三角圆形，赤道面观近半圆形；孢子极轴长47～50 μm，赤道轴长50.5～53 μm；孢子表面具网状纹饰(图版Ⅰ：1～2)。

接种5～7 d后，孢子壁沿三裂缝开裂，孢子细胞分裂产生一个原叶体原始细胞，其内充满叶绿体，标志着孢子萌发；此时孢子壁常裂成3瓣，其中1瓣常顶在丝状体前端(图版Ⅰ：3)。假根从孢子的三裂缝处伸出。银粉背蕨的孢子萌发类型为书带蕨型(Vittaria-type)[10]。

2.1.2 丝状体和片状体

孢子接种7～12 d后，原叶体原始细胞通过平行于极轴的分裂产生基细胞和原叶体细胞，形成3个细胞的丝状体(图版Ⅰ：4)；基细胞不分裂，原叶体细胞横向分裂后纵向分裂产生2列细胞的丝状体。丝状体粗壮，长约3～7个细胞，细胞短桶形，其内叶绿体较多，丝状体基部产生2～3条假根。丝状体顶端常不出现楔形的顶端细胞。丝状体前端的细胞均处于分裂状态而成为分散生长，形成具长柄的匙形片状体(图版Ⅰ：5)。

2.1.3 原叶体

孢子接种17～20 d后，在片状体一侧的边缘细胞产生多细胞分生组织，分生组织分裂发育成幼原叶体(图版Ⅰ：6)。幼原叶体前端内凹，具左右明显不对称的两翼，两翼向斜上方伸展，较大的翼常具波状缘(图版Ⅰ：7)。

接种约35 d后，原叶体发育成熟。成熟原叶体为对称的倒卵状心脏形，两翼强力向原叶体上方扩展，边缘具圆钝的突起，后端尾尖；心脏形凹陷处两翼相互重叠，不具毛状体，原叶体宽大于长，大小为1～1.4 mm×1.2～1.6 mm(图版Ⅰ：8)。原叶体细胞中的椭圆形叶绿体清晰可见，分布均匀(图版Ⅰ：11)。银粉背蕨配子体发育类型为水蕨型(Ceratopteris-type)[10]。

图版Ⅰ 银粉背蕨配子体的发育 1～2.孢子；3.孢子萌发；4.丝状体；5.片状体；6～7.幼原叶体；8.成熟原叶体；9～10.颈卵器；11.原叶体的叶绿体；12～14.精子器；15.假根；16.精细胞；17.游动精子PlateⅠ Gametophyte development of A.argentea 1-2.Spore; 3.Spore germination; 4.Protonema; 5.Plate; 6-7.Young prothallus; 8.Mature prothallus; 9-10.Archegonium; 11.The chloroplasts in prothallus; 12-14.Antheridium; 15.Rhizoids; 16.Spermatid; 17.Spermatozoid

2.1.4 性器官

银粉背蕨多数为雌雄同株。接种约5～7周后出现性器官。颈卵器多分布在生长点附近。顶面观可见颈卵器具4列颈壁细胞(图版Ⅰ：9)，颈卵器颈部直径约56～59 μm，为5层细胞高(图版Ⅰ：10)。精子器分布于假根丛中或原叶体边缘。侧面观精子器圆柱状，由3个细胞(盖细胞、环细胞和基细胞)组成，高约50～55 μm，其中基细胞最大，盖细胞最小(图版Ⅰ：12)；顶面观精子器近圆形，直径约50 μm，其内球形的精细胞清晰可见，直径约14～15 μm(图版Ⅰ：13)。精子器成熟时，盖细胞大多孔裂，球形精细胞溢出(图版Ⅰ：14，16)。精细胞外膜解体，精子释放出来，精子呈螺旋形，具多根鞭毛(图版Ⅰ：17)。

2.1.5 假根

次生假根多发生在原叶体的基部和边缘，为单细胞管状，直径约11～12 μm，部分假根前端膨大或呈螺旋状；假根内偶有代谢物积累，呈黄褐色(图版Ⅰ：15)。

2.1.6 幼孢子体

经过2～3周的腐殖土培养，银粉背蕨孢子发育为肉眼可见的幼原叶体阶段，原叶体颜色较培养基中培养的原叶体颜色更为深绿(图版Ⅱ：1)。接种30 d后，发育为心形幼原叶体(图版Ⅱ：2)。接种35 d后，原叶体成熟且体积增加，平均长1.8 mm，宽2.4 mm(图版Ⅱ：3)。接种45 d后，成熟原叶体完成受精作用，发育到幼孢子体阶段。原叶体上长出的幼态叶呈团扇形，叶缘光滑，无毛状体等附属物(图版Ⅱ：4)，光学显微镜下可观察到幼态叶表面有气孔分布(图版Ⅱ：5)。接种8～9周后，每个配子体长出2～3个幼态叶，且原叶体逐渐变黄，此时是移栽的最佳时期。在解剖镜下，将银粉背蕨以配子体为单位的幼孢子体以3×3的排列方式移栽到直径12 cm的花盆中(图版Ⅱ：6)。

图版Ⅱ 银粉背蕨孢子的土壤繁殖 1～2.幼原叶；3.成熟原叶体；4.幼态叶；5.幼态叶上的气孔；6～11.分苗后的幼孢子叶发育过程；12.根系；13.土培苗PlateⅡ Soil propagation of spore in A.argentea 1-2.Young prothallus; 3.Mature prothallus; 4.Young leaf; 5.Stoma in the young leaf; 6-11.Different stages of young sporophytes; 12.Root system; 13.Sporophytes seedlings cultured in the soil

移栽3周后，幼孢子叶逐渐变大，叶缘开始内陷出现深裂(图版Ⅱ：7)。移栽6周后，幼孢子叶继续变大，叶缘叶裂加深，在原叶体上继续长出1～2个幼孢子叶(图版Ⅱ：8)。移栽10周后，幼孢子叶的叶缘内陷呈三裂，宽约3～4 mm(图版Ⅱ：9)。移栽14周后，叶片基部裂片继续分裂，发育为掌状五裂的幼孢子叶(图版Ⅱ：10)。移栽5个月后，孢子叶背部开始出现白色粉状物，不定根系发达，粗壮，多分支(图版Ⅱ：11～12)。经粗略统计，银粉背蕨孢子土培萌发率约为70%以上，成苗率可达90%(图版Ⅱ：13)。

2.2 培养基pH值对银粉背蕨配子体发育的影响

利用不同pH值培养基培养银粉背蕨的孢子，其孢子萌发和配子体发育存在显著差异(表1)。接种1周后，第1组的孢子未萌发；第2～6组的孢子萌发，并发育为丝状体，其中第6组的丝状体发育最快。接种3周后，第1组的孢子萌发，长成约2个细胞的丝状体，第2～3组处于丝状体末期，且产生具分支片状体，两分支发育不同步。第4组的配子体发育到片状体末期，第5～6组已发育成幼原叶体。接种后第5周，第1～3组发育成幼原叶体，第4～6组原叶体发育成熟，且已受精。

第1组因pH值偏低，培养基未完全凝固，只有部分孢子萌发，且生长十分缓慢。第6组孢子最先萌发，配子体发育速度最快，少有畸形配子体出现。因此，培养基pH值在7.0～9.0时随着碱性的增强，银粉背蕨的孢子萌发和配子体生长发育速度逐渐增加。因此，银粉背蕨孢子培养的最适培养基pH值范围为7.0～9.0。

3 讨论

本文研究结果表明，银粉背蕨孢子具三裂缝，呈辐射对称，孢子萌发为书带蕨型，原叶体发育为水蕨型，丝状体、片状体、颈卵器和精子器的形态，成熟原叶体为裸露的对称心脏形等特征与黄笛等[5]的研究基本一致；但在孢子表面纹饰、成熟原叶体边缘形态、性器官出现时间和假根直径等方面存在差异，可能与粉背蕨属植物配子体发育过程中变异性极大[10]、培养环境条件以及观察手段等因素有关。可见，银粉背蕨的孢子对称性和萌发类型、原叶体发育类型、丝状体、片状体、性器官的形态等是相对稳定的形态特征，可以用于分类和演化研究。

银粉背蕨的孢子体生长在石灰岩石缝或墙缝中[1]，其配子体在pH4.0～9.0的培养基中都可以生长，但在最适pH7.0～9.0的碱性培养基中萌发快，配子体发育速度快，生长状态良好。小黑桫椤(Alsophilametteniana)孢子体生长在台湾、福建、广东、贵州、四川、云南、江西等山坡林下、溪旁或沟边[11]，其孢子萌发和配子体发育需要在pH值3.7～6.7的酸性土壤进行[12]。同样生于山麓沟边及林下阴处酸性土上的金毛狗(Cibotiumbarometz)在pH值为3.0～6.0时孢子能够萌发形成配子体，而在pH为7.0时不萌发[13～14]。因此，蕨类植物配子体和孢子体的生境酸碱范围具有相对一致性，在孢子培养时可以根据孢子体的生长环境确定其配子体的基质最适pH值范围，使人工孢子培养易于成功。

人工孢子繁殖在资源蕨类植物应用方面前景广阔。黄笛等[5]用4种常规基质(草炭土、园土、蛭石、混合基质)培养银粉背蕨孢子，其中混合基质(泥炭土+河沙1∶1)的萌发率达65%以上，成苗率达83.2%，从播孢到小苗形成需要8周时间。王琳等[4]以银粉背蕨叶柄为材料，经过组织培养产生的试管苗移栽成活需要6个月左右。本研究将银粉背蕨孢子于商用腐殖土中培养，孢子萌发率为70%以上，成苗率高达90%，7～8周成苗，且成苗粗壮，叶片健康，根系发达。可见，相对于在无机培养基中的无菌培养和常规组织培养，腐殖土培养具有操作简单，不需要繁杂的接种和移栽驯化等步骤，生长周期短，成活率高，成苗发育好且成本低等优势，腐殖土还具有良好的保水力，透气性和养分充足供应[5]等优点。因此，利用腐殖土扩繁银粉背蕨对于其商业化规模扩繁具有现实意义。

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The Shanghai Natural Science Foundation(15ZR1430500)；The issue of Shanghai science and technology committee (14DZ2260400)；The problem of Shanghai Administration on City Appearance and Environmental Sanitation(G152430)；The Innovation project of University Students of Shanghai Municipal Education Commission(A-9103-14-007111)

introduction：CHEN Si-Qi(1995—),female,undergraduate,mainly study on artificial cultivation of ferns.

date:2016-09-09

DevelopmentofGametophyteandYoungSporophyteoftheFernAleuritopterisargentea

CHEN Si-Qi JIAN Jin-Jing ZHANG Yan DAI Xi-Ling*

(College of Life and Environment Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234)

Aleuritopterisargenteais a small ornamental ferns. We observed the developmental features of gametophyte and sporophyte ofA.argenteacultured in Knop’s medium and humus medium using microscopical techniques, and studied the optimum pH value for the gametophyte development. The results show that: (1)the spores are yellow-brown, tetrahedral, and trilete with reticulate ornamentations. Polar view is triangle circle and the equatorial view is nearly semicircular. The germination is Vittaria-type and the gametophyte development is Ceratopteris-type. The mature gametophytes are cordate. The archegonia and antheridia are leptosporangiate-type. No hairs are formed during gametophyte development. The above features of the gametophytes in the fernA.argenteaare stable. (2)the enhancement the pH value in 7.0-9.0 is beneficial for spore germination and gametophyte development. (3)the spore and gametophytes develop on humus medium produced seedlings after 7-8 weeks. The viability of sporophytes obtain in this medium are strong with developed roots and easy to transplant. Percentage of seedling emergency reaches to 90%. Our investigation is benefit for the artificial propagation and evolution of the resource plantA.argentea.

Aleuritopterisargentea；gametophyte development；young sporophyte；pH

上海市自然科学基金(15ZR1430500)；上海市科学技术委员会课题(14DZ2260400)；上海市绿化市容管理局科学技术攻关项目(G152430)；上海市教育委员会大学生创新项目(A-9103-14-007111)

陈思琦(1995—)，女，本科，主要从事蕨类植物人工培养方面的研究

* 通信作者：E-mail:daixiling2010@shnu.edu.cn

2016-09-09

* Corresponding author：E-mail:daixiling2010@shnu.edu.cn

S682.35

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.002